CI Chloroform-isoamyl alcohol
3.2.Phân tích cấu trúc quần xã vi khuẩn bằng điện di biến tính (DGGE)
Phơng pháp điện di biến tính - DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) đợc ứng dụng phổ biến trong nghiên cứu đa dạng, phân tích cấu trúc di truyền của quần xã vi khuẩn cũng nh xác định các nhóm vi khuẩn chiếm u thế trong các môi trờng sinh thái khác nhau (Norris và cs, 2002; Sekiguchi và cs, 2002; Bano và Hollibaugh, 2002; Avrahami, 2002; Nicol và cs, 2003; Crump và cs, 2003). Với mục đích xác định nhóm vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate chiếm u thế tại các môi trờng nghiên cứu, chúng tôi tiến hành phân tích cấu trúc quần xã vi khuẩn trong các ống MPN ở độ pha loãng 10−3 (là nồng độ gần tới hạn của dãy MPN đối với cả 3 mẫu) bằng phơng pháp PCR-DGGE đoạn gen 16S rDNA (hình 9). Các băng điện di đợc cắt từ gel và sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR sau đó để xác định trình tự và so sánh với các trình tự 16S rDNA đã công bố trong ngân hàng dữ liệu GeneBank.
Hình 9. Phổ điện di biến tính (DGGE) phân tích đoạn 16S rDNA của quần xã vi khuẩn trong các ống MPN của các mẫu nghiên cứu. A - Bùn đáy ao nớc ngọt;
R - Bùn chân ruộng ngập nớc; B - Trầm tích ven biển.
Anaeromyxobacter sp.
Pseudomonas sp.
A R B
Có thể thấy rằng nhóm vi khuẩn thuộc chi Anaeromyxobacter có mặt trong cả 3 dạng môi trờng nghiên cứu. Đây là nhóm vi khuẩn nằm trong phân lớp δ-
Proteobacteria, hiện mới chỉ có một loài duy nhất đợc công bố là A. dehalogenans
cùng với một số đại diện cha định danh đến loài. Các chủng Anaeromyxobacter đã công bố đều sinh trởng kỵ khí khử Fe(III), cha có chủng nào đợc nghiên cứu về khả năng sinh trởng khử nitrate, sử dụng Fe(II) làm chất cho điện tử (Treude và cs, 2003; Straub và cs, 1996, 1998). Trong môi trờng nuôi cấy sử dụng ở đây (cũng nh trong điều kiện tự nhiên), Fe(III) đồng thời tồn tại với Fe(II) do kết quả chuyển hoá Fe(II) bằng con đờng hoá học (phản ứng với lợng nhỏ oxy trong môi trờng) và con đờng sinh học (do các vi sinh vật oxy hoá Fe(II), khử nitrate). Do vậy, sự có mặt của các loài sinh trởng kỵ khí khử Fe(III) nh Anaeromyxobacter trong điều kiện môi trờng nghiên cứu ở đây (cũng nh trong tự nhiên) là mắt xích khép kín chu trình chuyển hoá sắt tại đây.
Hai nhóm vi khuẩn Paracoccus và Pseudomonas tơng ứng chiếm u thế trong mẫu bùn ao nớc ngọt và chân ruộng ngập nớc. Đây là hai chi vi khuẩn thuộc lớp
Proteobacteria, có nhiều đại diện sinh trởng kỵ khí khử nitrate, bao gồm cả các loài có khả năng sử dụng Fe(II) làm chất cho điện tử (Weber và cs, 2006b; Ratering và Schnell, 2001; Schafleigh, 2000). Nh vậy có thể kết luận rằng trong môi trờng nớc ngọt tại Việt Nam (đại diện là ao nớc ngọt và ruộng ngập nớc), Paracoccus và
Pseudomonas là các nhóm vi khuẩn đóng vai trò chính trong việc oxy hoá Fe(II) bằng nitrate. Tuy nhiên, trong môi trờng nớc lợ bằng phơng pháp này hiện cha xác định đợc nhóm vi khuẩn chiếm u thế. Nguyên nhân có thể do sự kém cạnh tranh của vi khuẩn khử nitrate nói chung so với các nhóm kỵ khí khác, đặc biệt là nhóm vi khuẩn khử sulfate trong môi trờng này (Schafleigh, 2000).
3.3. Đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn trong các môi trờng nghiên cứu bằng phơng pháp FISH
FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) là phơng pháp xác định trực tiếp (không qua bớc phân lập và nuôi cấy) mối liên quan phả hệ của vi khuẩn trong môi
trờng sống của chúng thông qua các đầu dò đánh dấu huỳnh quang có thể bắt cặp với rRNA (Amann và cs, 1995).
Hình 10. Hình ảnh hiển vi của tế bào vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu bắt cặp với đầu dò huỳnh quang .
Theo kết quả nghiên cứu của một số công trình đã công bố, nhóm vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate thờng thuộc vào phân lớp α-, β- và γ-Proteobacteria
(Chaudhuri và cs, 2001; Edwards và cs, 2003) vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng ba đầu dò ALF968, BET42a và GAM42a tơng ứng bắt cặp đặc hiệu với rRNA của các vi khuẩn thuộc ba phân lớp trên. Tỷ lệ vi khuẩn mỗi nhóm đợc tính theo tỷ lệ số tế bào bắt cặp với đầu dò (hình 10) tơng ứng trên tổng số tế bào đợc nhuộm DAPI.
Phần không bắt cặp với một trong ba đầu dò đợc sử dụng ở đây đợc gọi là phần không xác định (KXĐ) (hình 11). Thí nghiệm lai với các đầu dò chỉ cho kết quả đối với mẫu từ hai môi trờng nớc ngọt là bùn chân ruộng ngập nớc và bùn đáy ao nớc ngọt. Riêng đối với mẫu trầm tích ven biển, không cho kết quả dơng tính đối với cả 3 đầu dò. ở hai mẫu dơng tính đều cho kết quả với đầu dò ALF968, riêng đầu dò GAM42a và BET42a chỉ cho kết quả dơng tính tơng ứng ở mẫu bùn chân ruộng ngập nớc và mẫu bùn đáy ao nớc ngọt (hình 11). Nh vậy, bằng phơng pháp này chúng tôi không xác định đợc mức độ đa dạng di truyền của mẫu trầm tích ven biển với 3 đầu dò sử dụng.
Hình 11. Kết quả phân tích đa dạng di truyền vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu bằng phơng pháp FISH.