CI Chloroform-isoamyl alcohol
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
Các phơng pháp, nội dung nghiên cứu đợc sử dụng trong đề tài đợc tóm tắt bằng sơ đồ thí nghiệm thể hiện ở hình 6.
2.2.1. Xác định số lợng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate
Bảng 1. Môi trờng khoáng kỵ khí nớc ngọt và nớc lợ cho vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate (Ratering, 1999).
Thành phần Nớc ngọt Nớc lợ Nớc cất 1 lít 1 lít NaCl 1 g 13,7 g MgCl2.6H2O 0,4 g 5,9 g CaCl2.2H2O 0,15 g 0,81 g KCl 0,5 g 0,58 g KBr - 0,05 g MgSO4.7H2O 0,25 g 0,25 g NH4Cl 0,25 g Hỗn hợp NH4Cl và KH2PO4 KH2PO4 0,2 g
Khử trùng ở 121oC trong 25 phút, lấy ra ở 80oC, sục khí N2 trong 5 phút, làm nguội Thêm các dung dịch sau (đã khử trùng riêng):
Hỗn hợp Vitamine (bảng 2) 1 ml 1 ml Hỗn hợp vi lợng (bảng 2) 1 ml 1 ml Vitamin B1 (Thiamin) 1 ml 1 ml Vitamin B12 0,1 ml 0,1 ml Vitamin B2 1 ml 1 ml Na- Acetate 1 M 1 ml 1 ml NaNO3 1 M (chất nhận điện tử) 5 ml (5 mM) 5 ml (5 mM) FeSO4 1 M (chất cho điện tử) 10 ml (10 mM) 10 ml (10 mM)
NaHCO3 1 M 30 ml 30 ml
Chuẩn pH ở 7 - 7,2, sau đó chia môi trờng sang các bình serum và ống nghiệm rồi sục khí N2, đậy bình và ống nghiệm bằng nút cao su có kẹp nhôm hay nút vặn có lỗ hở
Bảng 2. Thành phần hỗn hợp vi lợng và vitamine. Hỗn hợp Vi lợng Hỗn hợp Vitamine Thành phần mg/L nớc cất Thành phần mg/100 ml đệm phosphate
Na2EDTA 5200 Na2HPO4/NaH2PO4 25 mM pH 7,1: 100 ml FeSO4.7H2O 2100 4-Aminobenzoic acid 4 H3BO3 30 D(+)- Biotin (Vitamine H) 1 MnCl2.4H2O 100 Nicotinic acid (Niacin) 10 CoCl2.6H2O 190 Calcium-D(+)- Pantothenat 5 NiCl2.6H2O 24 Pyridoxin 2 HCl 15
CuCl2.2H2O 2 Lopoic acid 1,5
ZnSO4.7H2O 144 Folic acid 4
Na2MoO4.2H2O 36 Na-2- Mercaptoethan sulfonat 25 Chuẩn pH = 6,5 bằng NaOH
Số lợng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate đợc xác định thông qua phơng pháp MPN (American Public Health Association, 1969). Phơng pháp này đợc xây dựng dựa trên phép pha loãng mẫu và số lợng ống dơng tính (sinh trởng) và âm tính (không sinh trởng) trong các dãy pha loãng. Biểu hiện dơng tính có thể là sự có mặt của khí trong các ống lên men, độ đục của môi trờng, sự biến đổi màu của môi trờng hay sự thay đổi pH tùy thuộc vào các trờng hợp khác nhau (USDA, 2008; Downes và Ito, 2001).
Môi trờng dịch thể kỵ khí hoàn toàn có thành phần khoáng tơng ứng với nớc ngọt (dùng cho mẫu bùn từ đáy ao và chân ruộng ngập nớc) hoặc nớc lợ (dùng cho mẫu trầm tích ven biển Vân Đồn - Quảng Ninh) (bảng 1). Thí nghiệm MPN đợc tiến hành với dãy pha loãng đến 10- 8 với thể tích 10% bùn đáy hoặc trầm tích trong môi trờng khoáng nớc ngọt hay nớc lợ, thí nghiệm đợc tiến hành với 3 dãy pha loãng, mẫu đợc đảm bảo kỵ khí hoàn toàn và ủ trong tủ ấm tại 28oC trong 8 tuần. Sự phát triển của vi khuẩn trong ống MPN đợc ghi nhận thông qua sự thay đổi màu môi tr- ờng từ trắng đục (màu của Fe(II)) sang vàng nâu (màu của Fe(III)).