Vi khuẩn P. aeruginosa và S. aureus là hai loại vi khuẩn sinh proteinase ngoại bào điển hình. Proteinase của chúng rất đa dạng và tham gia vào nhiều quá trình bệnh học. Vì vậy, đã tiến hành điện di các PA dịch nuôi cấy hai loài
trên và nghiên cứu khả năng ức chế của dịch chiết polyphenol tổng số của các mẫu vỏ hạt già và gỗ Tô mộc đối với proteinase của mỗi loài.
Trớc khi tiến hành thí nghiệm này, chúng tôi thu nhận chế phẩm protease từ dịch môi trờng nuôi cấy bằng cách kết tủa với acetone ở nhiệt độ thấp và xác định hoạt độ phân giải protein (PA) của dịch nuôi cấy hai loài vi khuẩn này.
Kết quả cho thấy hoạt độ proteinase của P. aeruginosa là 1,27 HP/ml và của S. aureus là 0,06 HP/ml; hoạt độ thủy phân của S. aureus yếu hơn P. aeruginosa rất nhiều do đó đã không phát hiện đợc khả năng ức chế ở các thí nghiệm trên. Vì vậy đã nghiên cứu tác dụng ức chế proteinase của S. aureus
bằng phơng pháp điện di.
Bớc đầu tìm hiểu các loại proteinase trong dịch nuôi cấy P. aeruginosa
và S. aureus đã tiến hành ủ bản gel ở các pH khác nhau: 4,5; 6,5 và 8, độ sáng các băng PA không thay đổi nhiều nhng có xu hớng sáng rõ hơn ở pH kiềm. Kết quả này phù hợp với đặc tính sinh proteinase kiềm của hai loài vi khuẩn này [52, 54].
(1) (2)
Kết quả điện di cho thấy proteinase của hai loài rất khác nhau, PsA có ít nhất 3 băng và có độ di động tơng đối chậm (P1, P2, P3). StA cũng có ba băng nh có độ di động cao hơn nhiều (P4, P5, P6).
3.5.2 Nghiên cứu PIA bằng phơng pháp điện di
Để tìm hiểu khả năng ức chế protease, chúng tôi tiến hành theo các cách khác nhau:
- ủ enzyme với dịch nghiên cứu 20 phút trớc khi điện di. - Trộn dịch nghiên cứu vào bản gel cùng với cơ chất.
- Sau khi điện di PA, ủ bản gel trong đệm Sorrensen pH 7,6 cùng với dịch nghiên cứu.
- Kết hợp cả 3 cách trên.
Bản điện di sau đó đợc nhuộm bằng 2 thuốc nhuộm là Amido Black 10B và Coomassie Brilliant Blue R250.
(1) ( 2)
Hình 3.9. Điện di đồ PsA (1), StA (2)
(trên gel có dịch chiết vỏ hạt Tô mộc chín với nồng độ polyphenol là 0,4 mg/ml) (a) Bản gel không chứa mẫu nghiên cứu
(b) Bản gel có chứa mẫu nghiên cứu
Nghiên cứu cho thấy khi nhuộm bản gel với Amido Black 10B cho kết quả tốt hơn, do đó các băng PA sáng rõ, ít bị ảnh hởng bởi màu của dịch nghiên
cứu. Trong các cách trên, khi trộn dịch nghiên cứu trong bản gel cùng với cơ chất thì khả năng ức chế proteinase rõ ràng nhất. Khi kết hợp cả 3 cách, bản gel bắt màu với thuốc nhuộm khá đậm, vì vậy cách thứ 2 là cách tốt nhất cho thí nghiệm này.
Các mẫu nghiên cứu đều làm giảm hoạt độ của các băng PA, thậm chí còn có thể ức chế hoàn toàn các băng yếu.
3.6 Hoạt tính kháng khuẩn các mẫu Tô mộc
Thăm dò khả năng kháng khuẩn của mẫu gỗ lên hai loài vi khuẩn S. aureus và P. aeruginosa, kết quả cho thấy dịch chiết mẫu vỏ hạt chín có khả năng khánh mạnh hai loài này. Các dịch chiết mẫu gỗ ở nồng độ cao cũng kháng cả hai loài.
Hình 3.10. Hoạt tính kháng khuẩn
1. DC polyphenol tổng số gỗ Tô mộc tác dụng lên S. aureus
2. DC flavonoid gỗ Tô mộc tác dụng lên S. aureus
3. DC polyphenol tổng số gỗ Tô mộc tác dụng lên P. aeruginosa
4. DC polyphenol tổng số vỏ hạt chín tác dụng lên S. aureus
3.7 Phân chia các thành phần flavonoid trên cột silicagel silicagel
Để tìm hiểu sâu hơn flavonoid toàn phần của dịch chiết gỗ Tô mộc, chúng tôi tiến hành sắc ký lớp mỏng đồng thời với một số chất chuẩn flavonoid hay gặp nh catechin, rutin, quercetin và nhận thấy có một băng sắc ký có độ di động tơng đơng với chất chuẩn quercetin, do đó đã tiến hành phân chia trên cột silicagel pha thờng để tìm hiểu rõ hơn các thành phần có hoạt tính PIA của dịch chiết gỗ Vang.
Qua thăm dò trên bản sắc ký, đã chọn đợc hệ dung môi chloroform : ethylacetate : acid formic (5:3:0,4) là hệ dung môi đơn giản và có khả năng phân tách tốt. Các phân đoạn thu đợc sau khi sắc ký đợc kiểm tra sự phân chia trên bản mỏng cũng nh hoạt tính PIA bằng phơng pháp khuếch tán.
Hình 3.11. Sắc ký bản mỏng các thành phần polyphenol sau khi qua cột silicagel (dung môi sắc ký bản mỏng là hệ dung môi chạy cột)
I, II, III, IV, V: các phân đoạn 7: quercetin
Dựa vào sắc ký đồ, đã thu riêng các phân đoạn có phổ sắc ký tơng đơng đợc 5 phần chín (I, II, III, IV, V) để kiểm tra hoạt tính ức chế proteinase bằng phơng pháp khuếch tán, kết quả thể hiện ở hình 3.12.
Hình 3.12 cho thấy các phần I, III, IV, V thu đợc khi sắc ký cột đều có PIA trong đó phần I và III có khả năng ức chế rõ ràng hơn cả. Từ các kết quả trên cho thấy có nhiều thành phần flavonoid của cây gỗ Vang tham gia vào khả năng ức chế proteinase.
Hình 3.12. PIA các phân đoạn sắc ký
(a) trypsin (b) chymotrypsin (c) PsA 1-2: E + H2O ; 3-4: E + I 5-6: E + II ; 7-8: E + III 9-10: E + IV ; 11-12: E + V
Để tìm hiểu sơ bộ bản chất của các băng này, phần I có một băng di động trùng với quercetin là một flavonoid đợc cho là có khả năng tơng tác và ức chế trypsin [11], do vậy đã tiếp tục tái sắc ký trên cột silicagel với hệ dung môi chloroform : ethylacetate (5:3), kết quả chúng tôi đã tách riêng đợc băng này với độ tinh sạch khá cao kí hiệu là GV1 và GV2. GV1 có độ di động tơng đơng với quercetin. 1 3 7 4 8 11 12 (a) (b) (c)
Hình 3.13. Sắc ký đồ các phân đoạn thu đợc sau khi tái sắc ký phân đoạn I
1. Chất chuẩn quecertin 2. GV1
3. GV2
GV1 và GV2 sau đó đợc thử PIA, kết quả là GV1 có hoạt độ ức chế proteinase rõ rệt.
Hình 3.14 PIA của các phân đoạn GV1 và GV2 1-2: T(trypsin) + H2O, 3-4: T+ GV2 5-6: T+GV1; 7-8 C(chymotrypsin) + H2O; 9-10: C+GV2; 11-12: C+GV1; 13-14: PsA+H2O; 15-16: PsA+GV2; 17+18: PsA+GV1 1 3 4 7 8 11 12 15 16 18
Hình 3.15 Phổ hấp thụ UV-Vis của GV1 và GV2
Hình 3.13 cho thấy mặc dù GV1 có độ di động tơng tự với quercetin nh- ng phổ UV-Vis hình 3.15) lại cho thấy GV1 chỉ có hai đỉnh hấp thụ ở vùng tử ngoại < 280nm (đặc trng của nhóm isoflavone), GV2 có thêm vùng hấp thụ > 290nm giống nh quercetin (đăc trng của nhóm flavonol) [8], vì vậy cần có những nghiên cứu sâu hơn về hai phân đoạn này. Nhiều tài liệu cho thấy trong gỗ Tô mộc có chứa nhiều dẫn xuất homoisoflavonoid [42,43], homoisoflavonoid cũng có khả năng ức chế protease [57], phải chăng GV1 là một homoisoflavonoid. Chúng tôi đã gửi mẫu GV1 đi phân tích để xác định cấu trúc của chất có mặt trong phân đoạn này.
Quecertin
GV1
Kết luận
1. Đã thăm dò đợc 26 mẫu của 20 cây thuốc thuộc 17 họ khác nhau trong đó có 21 mẫu của 16 cây (80% các cây nghiên cứu) có khả năng ức chế một số
proteinase serine (trypsin, chymotrypsin, proteinase tách từ P. aeruginosa), khả
năng ức chế chymotrypsin là cao nhất. Các mẫu có PIA cao là vỏ hạt Tô mộc chín, Đại hoàng, Đơn tớng quân, Trâm bầu, Sắn thuyền, trong đó TIA, PsIA, ChIA theo thứ tự đều cao hơn 3.500, 4.000 10.000 (mIU/g bột khô). Mẫu Sắn thuyền có PIA cao nhất, TIA, PsIA, ChIA, lần lợt vào khoảng: 36.691, 25.852, 105.148 mIU/g bột khô.
2. Dịch chiết ethanol của các mẫu có PIA cao cũng có hàm lợng polyphenol cao: từ 46 đến 62 mg/g bột khô. PIA của dịch chiết ethanol cao hơn nhiều lần dịch chiết nớc, đặc biệt dịch chiết polyphenol tổng số vỏ hạt Tô mộc chín là mẫu có PIA cao nhất trong các mẫu nghiên cứu, TIA, PsIA, ChIA lần lợt là 74.016, 99.025, 530.681 mIU/g bột khô. Hoạt độ riêng (mIU/g polyphenol) của các mẫu rất khác nhau.
Dịch chiết flavonoid của các mẫu cũng ức chế các proteinase nhng tơng đối thấp.
3. Với các mẫu Tô mộc, polyphenol của gỗ, vỏ thân, vỏ hạt chín và vỏ hạt xanh lần lợt là: 59, 96,84, 51,93 và 21,39 mg/g khô. Hàm lợng tannin hạt Tô mộc chín cao nhất trong 4 mẫu, đạt 26,6% polyphenol tổng số.
Hàm lợng flavonoid của các mẫu này chiếm tỉ lệ tơng đối thấp từ 3% - 9% polyphenol tổng số. Riêng mẫu gỗ Tô mộc tỉ lệ flavonoid/polyphenol tổng số là 75,4%, cao nhất trong các mẫu điều tra.
4. PIA của các băng flavonoid tách đợc sau khi sắc ký trên bản mỏng các mẫu Tô mộc cho thấy: hầu hết các băng/vùng băng của mẫu gỗ đều ức chế các proteinase nghiên cứu ở mức độ khác nhau; mẫu vỏ thân: chỉ có vùng băng di động chậm nhất và băng không di động có hoạt độ ức chế; mẫu vỏ hạt: PIA chỉ đợc phát hiện ở vùng polyphenol không di chuyển trên bản sắc ký.
5. Nghiên cứu ảnh hởng của các dịch chiết polyphenol tổng số của mẫu vỏ
hạt Tô mộc chín và gỗ Tô mộc lên PA của P. aeruginosa và S. aureus bằng phơng
6. Dịch chiết các mẫu Tô mộc đều có khả năng ức chế sự phát triển của hai loài P. aeruginosa và S. aureus.
7. Đã tiến hành sắc ký cột silicagel flavonoid mẫu gỗ Tô mộc và thu đợc 5 phân đoạn có PIA. Phân đoạn I đợc tiếp tục đợc tái sắc ký thu đợc 2 phân đoạn kí hiệu là GV1 và GV2 có phổ hấp thụ UV-Vis đặc trng cho nhóm chất flavonoid, trong đó GV1 có PIA rõ ràng hơn cả.
Kiến nghị
1. Tiếp tục điều tra nghiên cứu các cây thuốc chữa mụn nhọt, mẩn ngứa để làm rõ hơn mối liên hệ giữa khả năng ức chế proteinase và tác dụng dợc lý cũng nh mối liên hệ với hàm lợng và thành phần polyphenol của các cây. Nghiên cứu sâu hơn các mẫu có PIA và polyphenol cao.
2. Tìm hiểu thêm hoạt tính ức chế của các mẫu lên các proteinase khác, đặc biệt là các proteinase ngoại bào của các vi khuẩn khác có vai trò hình thành các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa. Xác định ảnh hởng của các mẫu tới từng loại proteinase của hai loài vi khuẩn đã khảo sát.
3. Tiếp tục tinh sạch và xác định các flavonoid trong gỗ Tô mộc có vai trò ức chế proteinase. Xác định công thức cấu tạo GV1, GV2 và nghiên cứu hoạt độ ức chế các proteinase khác.
Danh mục các công trình khoa học đ công bố ã
liên quan đến luận văn
1) Nguyễn Minh Thắng, Phạm Thị Trân Châu (2008), “Hoạt tính ức chế proteinaza của dịch chiết polyphenol trong cây gỗ Vang (Tô mộc)
Caesalpinia sappan L.” Tạp Chí Sinh học, Tập 30, Số 3: 114-120. (có đăng tóm tắt báo cáo ở Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, Hoá sinh và sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học và công nghiệp thực phẩm, Hà nội 15-17/10/2008, trang 648)
2) Pham Thi Tran Chau, Nguyen Minh Thang, Hoang Thu Ha (2008), "Proteinase inhibitory activity in an aqueous extracts and polyphenol fractions of Caesalpinia sappan wood and seed" , 20th FAOBMB Conference "Frontier in Life Sciences" October 23-25th, 2008, Taipei, Taiwan, Abtracts Book p.158.
Tài Liệu Tham Khảo Tiếng Việt
1. Phạm Thị Trân Châu (1992), “Đại cơng về các PPI”, Tạp chí Di truyền và ứng dụng, 1, tr. 22-24.
2. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2005), Công nghệ sinh học, tập 3: Enzyme và ứng dụng, NXB Giáo Dục, pp. 81-86.
3. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y Học.
4. Đào Hùng Cờng, Giang Kim Liên (2008), “Nghiên cứu xác định thành phần hóa học của dịch chiết từ gỗ Vang ở Quảng Nam”, Tạp chí khoa học Đại học Đà Nẵng, 24, tr. 63-68.
5. Phan Thị Hà (2000), Nghiên cứu proteinase của Pseudomonas N01 phân lập từ mủ bỏng, tác dụng của Momoseratin đến proteinase của chúng, Luận văn thạc sĩ khoa học, mã số 1.05.12, Trờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội.
6. Hoàng Thu Hà, Phạm Thị Trõn Chõu (2008), “Nghiờn cứu điều tra cỏc chất ức chế proteinaza của thõn và hạt Caesapinia sappan L.” Tạp chớ Khoa học ĐHQG Hà nội, KH TN &CN, 24(4), tr. 261 -270.
7. Nguyễn Quang Huy (2008), Nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn sâu răng Streptococcus mutans, Luận án Tiến sĩ sinh học, mã số 62. 42. 30. 15, Trờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội.
8. Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh (2004), Bài giảng dợc liệu, Tập 1, Đại học Dợc Hà Nội, Bộ môn Dợc liệu, tr. 259-290.
9. Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học kĩ thuật.
10.Đào Thị Kim Nhung (1996), Một số đặc tính hóa học và tác dụng sinh học của flavonoid trong cây thuốc thanh nhiệt Smilax glabra Roxb, Lactuca indica Linn, Lonicera japonica Thunb, Luận án phó tiến sĩ khoa học, mã số 01.05.10., Trờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội.
Tiếng Anh
11.Andersen O. M., Markham K. R. (2006), Flavonoids: Chemistry, biochemistry and Applications, Taylor & Francis Group, pp. 433-471.
12.Andrejko M., Cytryńka M., Jakubowicz T., 2005, “Apolipophorin III is a substrate for protease IV from Pseudomonas aeruginosa”, FEMS Microbiology Letters, 243, pp. 331-337.
13.Camp B. J., Zant W. C. (1957), “Proteolytic enzyme from Pseudomonase putrefaciens”, Food Research, 22, pp. 158.
14.Chang T.L. (2009), “Inhibitory effect of flavonoids on 26s proteasome activity”, Journal of Agricuture and Food Chemistry., 57 (20), pp. 9706- 9715.
15.Chen D., Landis-Piwowar KR., Chen MS., Dou QP. 2007), “Inhibition of proteasome activity by the dietary flavonoid apigenin is associated with growth inhibition in cultured breast cancer cells and xenografts”, Breast Cancer Research, 9(6), pp. 80.
16.Fang B, Song Y, Ma J, Zhao RC. (2007), “Severe epidermal necrolysis after bortezomib treatment for multiple myeloma”, Acta Haematologica, 118, pp. 65-67.
17.Fuke C., Yamahara J., Shimokawa T., Kinjo J., Tomimatsu T., Nohara T. (1985), “Two aromatic compounds related to brazilin from
18.Dewich P. M. (2002), Medicinal natural products, John Wiley & Son, pp. 8-9.
19.Domash V. I. , Sharpio T. P. , Zabreiko S. A. and Sosnovskaya T. F. (2008), “Proteolytic enzymes and trypsin inhibitors of higher plants under stress conditions”, Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 34(3), pp. 318- 322.
20.Engel L. S., Hill J. M., Caballero A. R., Green L. C. and O’Callaghan R. J., (1998), “Protease IV, a unique extracellular protease and virulence factor from Pseudomonas aeruginosa”, The Journal of Biological Chemistry, 273(27), pp. 16792-16797.
21.Hagerman E. A. (2002), Tannin chemistry, Department of Chemistry and Biochemistry, Miami University, Oxford, USA.
22.Hahn-Deinstrop E. (2007), Applied Thin-Layer Chromatography, WILEY- VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim.
23.Harborne, J.B. (1980), “Plant Phenolics. In: Secondary Plant Products” (eds E.A. Bell & B.W.Charlwood), Encyclopedia of Plant Physiology, New Series, 8, pp. 329-402.
24.Harborne J.B. (1994), The flavonoids advances in research since 1986, Chapman & Hall Ltd, London.
25.Họttenschwiler, S. & Vitousek, P.M. (2000), “The role of polyphenols in terrestrial ecosystem nutrient cycling”, Tree, 15, pp. 238–243.
26.Heussen C., Dowdle E. B. (1980), “Electrophoretic analysis of plasminogen ativators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and co- polymerized substrate”, Analytical Biochemistry., 102, pp. 196-202.
27.Hobden J. A. (2002), “Pseudomonas aeruginosa proteases and corneal virulence”, DNA and Cell Biology, 21(5-6) pp. 391-396.
28.Hodges L. D., George Kweifio-Okai and Macrides T. A., (2003), “Antiprotease effect of anti-inflammatory lupeol esters”, Molecular and Cellular Biochemistry, 252(1-2), pp. 97-101.
29.Hu J., Yan X., Wang W., Wu H., Hua L., Du L., (2008), “Antioxidant Activity In Vitro of three Constituents from Caesalpinia sappan L”,
Tsinghua Science & Technology, 13(4), pp. 474-479.
30.Iwashina T. (2000), “The structure and distribution of the flavonoids in plants”, Journal of Plant Research, 113, pp. 287-299.
31.John Smith H. and Simons C. (2009) Design of Caspase Inhibitors as Potential Clinical Agents, CRC Press, Taylor & Francis Group, LLC.
32.Kim J.H., Kim H.A, Baek S.H., Kho Y.H., Kim M.R., Lee C.H., (2003), “A caspase inducing inhibitor isolate from Caesalpinia sappan”, Korean medical database, 35(4) pp. 680-683.