Kết quả cho thấy thành phần flavonoid trong các cây thuốc rất đa dạng, khác nhau ở từng loại cây thuốc cũng nh các bộ phận của một cây.
Hình 3.4. Sắc ký đồ dịch chiết flavonoid toàn phần một số mẫu
(hệ dung môi TEAF (5:2:2:1), nhuộm H2SO4 10%)
1. Gỗ Vang 6. Đơn tớng quân
2. Vỏ thân gỗ Vang 7. Đại hoàng 3. Vỏ hạt Vang già 8. Đậu cọc rào 4. Vỏ hạt Vang non 9. Xoài
3.2.2 Sắc ký các thành phần polyphenol mẫu Tô mộc trên bản mỏng
Từ các thí nghiệm trên, chúng tôi nhận thấy các bộ phận mẫu Tô mộc có sự khác nhau rất lớn về PIA, hàm lợng polyphenol tổng số và flavonoid, hình 3.4 cũng cho thấy các thành phần polyphenol rất khác nhau, vì vậy đã tập trung nghiên cứu các mẫu này. Các dịch chiết qua các giai đoạn tách chiết của các mẫu Tô mộc tiếp tục đợc sắc ký trên bản mỏng và đợc nhuộm bằng hơn amoniac bão hòa, kết quả chỉ ra ở hình 3.5.
Để so sánh thành phần polyphenol của các mẫu nghiên cứu, đã tiến hành sắc ký dịch chiết các mẫu trên bản mỏng silicagel (lợng polyphenol chấm trên bảng sắc ký giống nhau). Hình 3.5 cho thấy sắc ký đồ polyphenol tổng số và flavonoid của gỗ Tô mộc tơng tự nhau và có nhiều băng nhất (vị trí thứ 2 và 3
Hình 3.5. Sắc ký đồ các thành phần polyphenol trong cây tô mộc với hệ dung môi TEAF (5:2:2:1)
(nhuộm hơi Amoniac bão hoà) 1. Acid gallic
2. DC EtOH gỗ Vang 3. Flavonoid gỗ Vang 4. Cặn không tan gỗ Vang 5. DC EtOH vỏ thân 6. Flavonoid vỏ thân 7. Cặn không tan vỏ thân
8. DC EtOH vỏ hạt chín 9. Flavonoid vỏ hạt chín 10. Cặn không tan vỏ hạt chín 11. DC EtOH vỏ hạt xanh 12. Flavonoid vỏ hạt xanh 13. Cặn không tan vỏ hạt xanh
trên sắc ký đồ), khoảng 11 băng; polyphenol hay flavonoid vỏ thân có ít nhất là 7 băng, các băng chính tơng ứng với các băng di động chậm của mẫu gỗ. Sắc ký đồ flavonoid của vỏ hạt chín và vỏ hạt xanh khá giống nhau, đều có 4 băng chính, băng đậm nhất có màu sắc và độ di động tơng ứng với acid gallic chuẩn (băng này không rõ lắm ở mẫu gỗ). Kết quả trên chứng tỏ polyphenol cũng nh flavonoid trong phần gỗ Tô mộc là đa dạng nhất, và có thành phần flavonoid khác nhiều so với vỏ hạt. Phần gỗ cây Tô mộc đã đợc sử dụng làm dợc liệu ở Việt Nam và nhiều nớc khác, có thể sự phong phú về thành phần flavonoid góp phần chính tạo nên tác dụng dợc lí của cây Tô mộc.
Khi xác định PIA các dịch chiết polyphenol tổng số và flavonoid, chúng tôi nhận thấy PIA của flavonoid các mẫu đều thấp hơn dịch chiết polyphenol tổng số nhiều lần nên các chất có thể PIA nằm lại ở phần không tan của dịch chiết polyphenol tổng số nên đã tiến hành hòa tan phần cặn này trong ethanol, sắc ký bản mỏng và nhận thấy phần lớn các chất này không di chuyển trên bản sắc ký. Phải chăng đây là các chất polymer hoá của các hợp chất phenolic và có khối lợng phân tử lớn nh các hợp chất tannin.
3.3 Thăm dò PIA của các băng polyphenol sau khi sắc ký bản mỏng
Các mẫu Đại hoàng, gỗ Tô mộc, vỏ thân Tô mộc, vỏ hạt Tô mộc xanh, vỏ hạt Tô mộc chín đợc sử dụng trong thí nghiệm này. Sau khi sắc ký, cắt một dải bản mỏng, nhuộm để xác định vị trí các băng, từ các băng này dóng hàng để cắt riêng các băng/vùng băng, tách rửa polyphenol từ mỗi băng bằng dung dịch ethanol, ly tâm loại bỏ silicagel, thu dịch trong, cho bay hơi dung môi, hoà tan cặn trong dung dịch đệm, xác định PIA.
Kết quả cho thấy, trong các mẫu nghiên cứu, PIA tập trung ở các băng có độ di động thấp, đặc biệt là vùng không di động trên bản mỏng.
1 2 4 5 6 3 ĐC
Mẫu đại hoàng có hai băng ức chế chính là băng 1 và 4, trong đó băng 1 ức chế tốt hơn. Các tài liệu cho thấy trong Đại hoàng có chrysophanol, emodin là các dẫn xuất của, đã có những nghiên cứu cho thấy các dẫn xuất anthroquinone có khả năng ức chế nhiều loại protease [35, 56]. Vì vậy chúng tôi không đi sâu nghiên cứu vào Đại hoàng.
3.3.2 PIA các băng flavonoid mẫu Tô mộc
Hình 3.6. PIA của các băng flavonoid khi sắc ký trên bản mỏng silicagel của mẫu Đại hoàng
Các băng đợc đánh số theo thứ tự từ vết chấm mẫu 1 , 2, 3... ĐC: đối chứng
1,2: E+nớc; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8 E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5; 15,16 E+6
ChIA
PPsIA TIA
Hình 3.7a. PIA của các băng flavonoid khi sắc ký trên bản mỏng silicagel của gỗ
Các băng đợc đánh số theo thứ tự từ vết chấm mẫu (1) , 2, 3 DC: đối chứng…
1,2: E+nớc; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8E+2; 9,10 E+3; 11,12
Hình 3.7a. PIA của các băng flavonoid khi sắc ký trên bản mỏng silicagel của gỗ, vỏ thân.
Các băng đợc đánh số theo thứ tự từ vết chấm mẫu (1) , 2, 3 DC: đối chứng…
4 1 3 7 11 8 15 12 16
Vỏ thõn 4 1 3 7 11 8 15 12 16 Gỗ ChIA PPsIA 1 2 3 4 5 ĐC STT Băng/ vựng băng mg polyphenol 1,68 2,99 3,55 0,49 0,73 ChIA PPsIA
Hình 3.7a. PIA của các băng flavonoid khi sắc ký trên bản mỏng silicagel mẫu gỗ Tô mộc, vỏ thân Tô mộc
Các băng đợc đánh số theo thứ tự từ vết chấm mẫu: 1 , 2, 3... ĐC: đối chứng 1,2: E+nớc; 3,4: E+ĐC; 5,6 E+1; 7,8E+2; 9,10 E+3; 11,12 E+4; 13,14 E+5;
Mẫu vỏ thân có thêm băng 6: 15,16: E+6
12 3 5 6 ĐC 4 8,07 1,65 2,04 0,05 0,03 0,06 STT Băng/ vựng băng mg polyphenol
48
Hình 3.7b. PIA của các băng flavonoid khi sắc ký trên bản mỏng silicagel vỏ hạt chín
Các băng đợc đánh số theo thứ tự từ vết chấm mẫu: 1 , 2, 3... DC: đối chứng 1,2: E+nớc; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8E+2;
Hình 3.7b. PIA của các băng flavonoid khi sắc ký trên bản mỏng silicagel vỏ hạt chín
Các băng đợc đánh số theo thứ tự từ vết chấm mẫu: 1 , 2, 3... DC: đối chứng 1,2: E+nớc; 3,4: E+DC; 5,6 E+1; 7,8E+2;
4 1 3 7 11 8 15 12 16 TIA ChIA PPsIA
Kết quả cho thấy cả 4 băng/vùng băng của mẫu gỗ (1, 2, 3, 4) ít nhiều đều có TIA, ChIA, PsIA, trong đó vùng băng 2 có hoạt độ mạnh nhất. Mẫu vỏ thân: chỉ có băng/vùng băng 1 và vùng băng (2+3) tơng ứng với vùng băng 2 của gỗ có TIA, ChIA, PsIA; đối với vỏ hạt chỉ có vùng băng 1 có các hoạt tính trên. Sự sai khác này cũng có thể do sai khác về lợng polyphenol trong mỗi băng nhng cũng có thể do sai khác về thành phần có PIA của mỗi mẫu.
Qua các thí nhiệm với các mẫu cây gỗ Vang, PIA của các mẫu nghiên cứu tập trung chủ yếu ở vị trí không di động trên bản sắc ký, do vậy có thể có khả năng vùng này là các hợp chất tannin.
STT Băng/ vựng băng 1 2 3 4 5 6 mg polyphenol DC 0,09 0,13 0,03 0,31 0,51 2,84 Vỏ hạt chớn
3.4 Hàm lợng tannin của các mẫu Tô mộc
Tannin có thể kết tủa không đặc hiệu với protein, làm bất hoạt nhiều enzyme. Vì vậy đã tiến hành định lợng tannin trong các bộ phận của cây Tô mộc bằng phơng pháp kết tủa tannin cùng với gelatin theo phơng pháp cải tiến mới đợc công bố năm 2009 [59]. Hàm lợng tannin đợc tính bằng hiệu số hàm l- ợng polyphenol trớc và sau khi kết tủa với gelatin.
Bảng 3.6. Hàm lợng tannin các bộ phận cây gỗ Vang Mẫu (mg/g chất Tannin khô) % tannin so với polyphenol tổng số Gỗ 9,0 15,5 Vỏ thân 19,3 19,9 Vỏ hạt chín 13,8 26,6 Vỏ hạt xanh 2,5 11,8
Mẫu vỏ thân có hàm lợng tannin cao nhất: 19,3 mg/g chất khô, khoảng 19,9 % lợng polyphenol tổng số có trong vỏ thân. Tannin có trong vỏ hạt già là 13,8 mg/g chất khô, 26,6% lợng polyphenol tổng số, cao nhất trong các mẫu. Mẫu vỏ hạt Tô mộc chín có tỉ lệ tannin cao nhất, hàm lợng flavonoid thấp nhất, lại là có PIA cao nhất, phải chăng tannin có vai trò quan trọng đến hoạt tính ức chế proteinase vỏ hạt chín.
3.5 Thăm dò hoạt độ ức chế proteinase bằng phơng pháp điện di Proteinase trên gel polyacryamide
Khả năng ức chế PsA không cao bằng khả năng ức chế trypsin và chymotrypsin tinh sạch, do đó chúng tôi sử dụng phơng pháp điện di PA trên gel có cơ chất casein 1% để nghiên cứu sâu hơn các proteinase và PIA.
3.5.1 Hoạt độ phân giải proteinase của P. aeruginosa và S. aureus
Vi khuẩn P. aeruginosa và S. aureus là hai loại vi khuẩn sinh proteinase ngoại bào điển hình. Proteinase của chúng rất đa dạng và tham gia vào nhiều quá trình bệnh học. Vì vậy, đã tiến hành điện di các PA dịch nuôi cấy hai loài
trên và nghiên cứu khả năng ức chế của dịch chiết polyphenol tổng số của các mẫu vỏ hạt già và gỗ Tô mộc đối với proteinase của mỗi loài.
Trớc khi tiến hành thí nghiệm này, chúng tôi thu nhận chế phẩm protease từ dịch môi trờng nuôi cấy bằng cách kết tủa với acetone ở nhiệt độ thấp và xác định hoạt độ phân giải protein (PA) của dịch nuôi cấy hai loài vi khuẩn này.
Kết quả cho thấy hoạt độ proteinase của P. aeruginosa là 1,27 HP/ml và của S. aureus là 0,06 HP/ml; hoạt độ thủy phân của S. aureus yếu hơn P. aeruginosa rất nhiều do đó đã không phát hiện đợc khả năng ức chế ở các thí nghiệm trên. Vì vậy đã nghiên cứu tác dụng ức chế proteinase của S. aureus
bằng phơng pháp điện di.
Bớc đầu tìm hiểu các loại proteinase trong dịch nuôi cấy P. aeruginosa
và S. aureus đã tiến hành ủ bản gel ở các pH khác nhau: 4,5; 6,5 và 8, độ sáng các băng PA không thay đổi nhiều nhng có xu hớng sáng rõ hơn ở pH kiềm. Kết quả này phù hợp với đặc tính sinh proteinase kiềm của hai loài vi khuẩn này [52, 54].
(1) (2)
Kết quả điện di cho thấy proteinase của hai loài rất khác nhau, PsA có ít nhất 3 băng và có độ di động tơng đối chậm (P1, P2, P3). StA cũng có ba băng nh có độ di động cao hơn nhiều (P4, P5, P6).
3.5.2 Nghiên cứu PIA bằng phơng pháp điện di
Để tìm hiểu khả năng ức chế protease, chúng tôi tiến hành theo các cách khác nhau:
- ủ enzyme với dịch nghiên cứu 20 phút trớc khi điện di. - Trộn dịch nghiên cứu vào bản gel cùng với cơ chất.
- Sau khi điện di PA, ủ bản gel trong đệm Sorrensen pH 7,6 cùng với dịch nghiên cứu.
- Kết hợp cả 3 cách trên.
Bản điện di sau đó đợc nhuộm bằng 2 thuốc nhuộm là Amido Black 10B và Coomassie Brilliant Blue R250.
(1) ( 2)
Hình 3.9. Điện di đồ PsA (1), StA (2)
(trên gel có dịch chiết vỏ hạt Tô mộc chín với nồng độ polyphenol là 0,4 mg/ml) (a) Bản gel không chứa mẫu nghiên cứu
(b) Bản gel có chứa mẫu nghiên cứu
Nghiên cứu cho thấy khi nhuộm bản gel với Amido Black 10B cho kết quả tốt hơn, do đó các băng PA sáng rõ, ít bị ảnh hởng bởi màu của dịch nghiên
cứu. Trong các cách trên, khi trộn dịch nghiên cứu trong bản gel cùng với cơ chất thì khả năng ức chế proteinase rõ ràng nhất. Khi kết hợp cả 3 cách, bản gel bắt màu với thuốc nhuộm khá đậm, vì vậy cách thứ 2 là cách tốt nhất cho thí nghiệm này.
Các mẫu nghiên cứu đều làm giảm hoạt độ của các băng PA, thậm chí còn có thể ức chế hoàn toàn các băng yếu.
3.6 Hoạt tính kháng khuẩn các mẫu Tô mộc
Thăm dò khả năng kháng khuẩn của mẫu gỗ lên hai loài vi khuẩn S. aureus và P. aeruginosa, kết quả cho thấy dịch chiết mẫu vỏ hạt chín có khả năng khánh mạnh hai loài này. Các dịch chiết mẫu gỗ ở nồng độ cao cũng kháng cả hai loài.
Hình 3.10. Hoạt tính kháng khuẩn
1. DC polyphenol tổng số gỗ Tô mộc tác dụng lên S. aureus
2. DC flavonoid gỗ Tô mộc tác dụng lên S. aureus
3. DC polyphenol tổng số gỗ Tô mộc tác dụng lên P. aeruginosa
4. DC polyphenol tổng số vỏ hạt chín tác dụng lên S. aureus
3.7 Phân chia các thành phần flavonoid trên cột silicagel silicagel
Để tìm hiểu sâu hơn flavonoid toàn phần của dịch chiết gỗ Tô mộc, chúng tôi tiến hành sắc ký lớp mỏng đồng thời với một số chất chuẩn flavonoid hay gặp nh catechin, rutin, quercetin và nhận thấy có một băng sắc ký có độ di động tơng đơng với chất chuẩn quercetin, do đó đã tiến hành phân chia trên cột silicagel pha thờng để tìm hiểu rõ hơn các thành phần có hoạt tính PIA của dịch chiết gỗ Vang.
Qua thăm dò trên bản sắc ký, đã chọn đợc hệ dung môi chloroform : ethylacetate : acid formic (5:3:0,4) là hệ dung môi đơn giản và có khả năng phân tách tốt. Các phân đoạn thu đợc sau khi sắc ký đợc kiểm tra sự phân chia trên bản mỏng cũng nh hoạt tính PIA bằng phơng pháp khuếch tán.
Hình 3.11. Sắc ký bản mỏng các thành phần polyphenol sau khi qua cột silicagel (dung môi sắc ký bản mỏng là hệ dung môi chạy cột)
I, II, III, IV, V: các phân đoạn 7: quercetin
Dựa vào sắc ký đồ, đã thu riêng các phân đoạn có phổ sắc ký tơng đơng đợc 5 phần chín (I, II, III, IV, V) để kiểm tra hoạt tính ức chế proteinase bằng phơng pháp khuếch tán, kết quả thể hiện ở hình 3.12.
Hình 3.12 cho thấy các phần I, III, IV, V thu đợc khi sắc ký cột đều có PIA trong đó phần I và III có khả năng ức chế rõ ràng hơn cả. Từ các kết quả trên cho thấy có nhiều thành phần flavonoid của cây gỗ Vang tham gia vào khả năng ức chế proteinase.
Hình 3.12. PIA các phân đoạn sắc ký
(a) trypsin (b) chymotrypsin (c) PsA 1-2: E + H2O ; 3-4: E + I 5-6: E + II ; 7-8: E + III 9-10: E + IV ; 11-12: E + V
Để tìm hiểu sơ bộ bản chất của các băng này, phần I có một băng di động trùng với quercetin là một flavonoid đợc cho là có khả năng tơng tác và ức chế trypsin [11], do vậy đã tiếp tục tái sắc ký trên cột silicagel với hệ dung môi chloroform : ethylacetate (5:3), kết quả chúng tôi đã tách riêng đợc băng này với độ tinh sạch khá cao kí hiệu là GV1 và GV2. GV1 có độ di động tơng đơng với quercetin. 1 3 7 4 8 11 12 (a) (b) (c)
Hình 3.13. Sắc ký đồ các phân đoạn thu đợc sau khi tái sắc ký phân đoạn I
1. Chất chuẩn quecertin 2. GV1
3. GV2
GV1 và GV2 sau đó đợc thử PIA, kết quả là GV1 có hoạt độ ức chế proteinase rõ rệt.
Hình 3.14 PIA của các phân đoạn GV1 và GV2 1-2: T(trypsin) + H2O, 3-4: T+ GV2 5-6: T+GV1; 7-8 C(chymotrypsin) + H2O; 9-10: C+GV2; 11-12: C+GV1; 13-14: PsA+H2O; 15-16: PsA+GV2; 17+18: PsA+GV1 1 3 4 7 8 11 12 15 16 18
Hình 3.15 Phổ hấp thụ UV-Vis của GV1 và GV2
Hình 3.13 cho thấy mặc dù GV1 có độ di động tơng tự với quercetin nh- ng phổ UV-Vis hình 3.15) lại cho thấy GV1 chỉ có hai đỉnh hấp thụ ở vùng tử ngoại < 280nm (đặc trng của nhóm isoflavone), GV2 có thêm vùng hấp thụ > 290nm giống nh quercetin (đăc trng của nhóm flavonol) [8], vì vậy cần có những nghiên cứu sâu hơn về hai phân đoạn này. Nhiều tài liệu cho thấy trong gỗ Tô mộc có chứa nhiều dẫn xuất homoisoflavonoid [42,43], homoisoflavonoid cũng có khả năng ức chế protease [57], phải chăng GV1 là một homoisoflavonoid. Chúng tôi đã gửi mẫu GV1 đi phân tích để xác định cấu trúc của chất có mặt trong phân đoạn này.
Quecertin
GV1
Kết luận
1. Đã thăm dò đợc 26 mẫu của 20 cây thuốc thuộc 17 họ khác nhau trong đó có 21 mẫu của 16 cây (80% các cây nghiên cứu) có khả năng ức chế một số
proteinase serine (trypsin, chymotrypsin, proteinase tách từ P. aeruginosa), khả
năng ức chế chymotrypsin là cao nhất. Các mẫu có PIA cao là vỏ hạt Tô mộc chín, Đại hoàng, Đơn tớng quân, Trâm bầu, Sắn thuyền, trong đó TIA, PsIA, ChIA theo thứ tự đều cao hơn 3.500, 4.000 10.000 (mIU/g bột khô). Mẫu Sắn thuyền có PIA cao nhất, TIA, PsIA, ChIA, lần lợt vào khoảng: 36.691, 25.852,