- Tổn thất đường trong quá trình nghiên cứu
Lactobacillus fermentum HA
kháng các vi sinh vật gây hại, phù hợp để sản xuất các chế phẩm probiotic.
III.2. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới quá trình tạo sinh khối của
Lactobacillus fermentum HA6
Trên thế giới Lactobacillus fermentum HA6 được nuôi cấy trong môi trường MRS để thu hồi sinh khối. Môi trường MRS là môi trường khá đắt tiền. Với điều kiện ở Việt Nam hiện nay, nếu sử dụng môi trường này để thu hồi sinh khối của chủng Lactobacillus fermentum HA6 tạo chế phẩm probiotic thì giá thành rất đắt, không phù hợp với thu nhập chung của người Việt Nam. Chính vì vậy, để đảm bảo có thể thu hồi sinh khối vi khuẩn HA6 với lượng lớn, giá thành rẻ, mà vẫn giữ được hoạt tính của nó, chúng tôi tiến hành tìm nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy thích hợp như sau.
III.2.1. Lựa chọn nguồn dinh dưỡng thích hợp cho quá trình phát triển của
Lactobacillus fermentum.
III.2.1.1 Ảnh hưởng của nguồn Cacbon
Tất cả các hợp chất hữu cơ xây dựng nên cơ thể tế bào vi sinh vật đều là các hợp chất chứa cacbon (thành tế bào, màng tế bào...) vì vậy ta cần khảo sát các nguồn hydratcacbon khác nhau với hàm lượng thích hợp để cho Lactobacillus fermentum có thể sử dụng dễ dàng khi đưa vào sản xuất nhằm giảm giá thành.
a) Khảo sát tốc độ sinh trưởng và phát triển của L. fermentum trên các loại đường khác nhau.
Chúng tôi tiến hành khảo sát trên 5 loại đường là glucoza, lactoza, sacaroza, maltodextrin, dịch thủy phân từ tinh bột sắn. Bởi vì đây là các loại đường có rất nhiều trên thị trường Việt Nam, giá thành rẻ.
Chúng tôi nuôi cấy HA6 trên môi trường đã thay thế các loại đường với cùng hàm lượng 20g/l, ở 370C, theo dõi sự phát triển của HA6 trong 24 tiếng được kết quả như hình 3.3. và bảng 3.2
Hình 3.3: Tốc độ sinh trưởng và phát triển của HA6 trên các loại đường khác nhau
Bảng 3.2:Ảnh hưởng của các loại đường đến sự phát triển của Ha6
Hàm lượng đường 20g/l
Glucoza Sacaroza Lactoza Ds MD Hàm lượng sk
(g/l)
17 14,6 15,8 11,6 1,4
Hiệu suất thu sk (%)
34 29,2 31,6 23,2 2,8
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy: Chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum HA6sử dụng khá
tốt các loại đường glucoza, sacaroza, lactoza, đường thủy phân từ tinh bột sắn, nhưng hầu như không sử dụng đường maltodextrin trong quá trình tạo sinh khối. Tuy nhiên, đường thủy
phân từ tinh bột phải trải qua giai đoạn thủy phân trước khi sử dụng và vi khuẩn sau khi lên men cho sinh khối thấp (11,6 g/l), đồng thời chủng HA6 sử dụng không đáng kể đường maltodextrin khó phân cắt đường này thành các phân tử nhỏ để vi khuẩn sử dụng, nên hai loại đường này không được lựa chọn.. Trong khi đó, hàm lượng sinh khối của đường sacaroza là khá đáng kể (14,6 g/l), tuy không bằng glucoza (17 g/l) và lactoza (15,8 g/l) nhưng với mục đích kinh tế, giá thành rẻ, dễ sử dụng nên chúng tôi chọn đường sacaroza làm nguồn cacbon.
b) Ảnh hưởng của hàm lượng đường sacaroza đến sự phát triển của HA6
Ở đây ta khảo sát hàm lượng đường từ 20g/l đến 80g/l. Sở dĩ chọn khoảng này bởi vì nếu khảo sát ở hàm lượng đường quá thấp thì không đủ cho sinh khối phát triển, còn nếu quá cao thì có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Kết quả thu được thể hiện ở hình 3.4. và bảng 3.3.
Hình 3.4: Ảnh hưởng của hàm lượng đường Saccaroza đến sự phát triển của HA6
Bảng 3.3: Các chỉ tiêu của chủng HA6 khi nuôi ở các hàm lượng đường Sacaroza khác nhau
Chỉ tiêu Hàm lượng đường Sacaroza (g/l)
Hàm lượng axit (g/l) 10,06 17,1 17,47 17,38 Hàm lượng đường sót (g/l) 1,13 5,2 18,77 30,22 Tổn thất (%) 12,15 18,1 20,2 28,4 Tế bào sống (CFU/ml) 8.107 3.108 3.108 7.109
Qua hình 3.4. ta nhận thấy: Nếu hàm lượng đường tăng từ 20g/l đến 60g/l thì hàm lượng sinh khối thu được cũng tăng lên nhưng hiệu suất thu hồi sinh khối lại giảm. Hiệu suất thu hồi sinh khối cao nhất là 29,2% đạt được khi hàm lượng đường là 20g/l trong khi đó hiệu suất thấp nhất là 9,41% khi hàm đường đạt 80g/l. Có thể giải thích rằng hàm lượng đường tăng nghĩa là cơ chất trong môi trường tăng mà tỷ lệ tiếp giống không đổi đã gây nên hiệu ứng thừa cơ chất. Mặt khác, khi hàm lượng đường cao, môi trường đặc, có sự chênh lệch nồng độ giữa trong và ngoài tế bào, làm cho nước từ bên trong tế bào vi khuẩn ra ngoài, vi khuẩn khó sinh trưởng và phát triển. Tuy nhiên cân nhắc cả hàm lượng sinh khối, hiệu suất thu hồi sinh khối và tỷ lệ sống của tế bào chúng tôi quyết định chọn hàm lượng đường 40g/l đưa vào nuôi cấy. Bởi vì theo bảng 3.3 lượng sinh khối của hàm lượng đường 40g/l là 26,1g/l lớn hơn hẳn hàm lượng đường 20g/l là 14,6g/l, còn hiệu suất thu hồi sinh khối không nhỏ hơn nhiều (25,1% so với 29,2%), đồng thời tỷ lệ sống của đường 40g/l là 3.108 lớn hơn 8.107 của đường 20g/l
Vậy sau khi đã khảo sát nguồn đường và hàm lượng đường chúng tôi quyết định chọn nguồn cacbon là sacaroza với hàm lượng 40g/l để đưa vào nuôi cấy.
III.2.1.2. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ
Như ta đã biết, trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn (MRS) phải sử dụng một số nguồn nitơ đặc biệt và khá đắt như pepton, cao thịt, cao men. Vì vậy xu hướng sử dụng các nguồn nitơ thay thế để áp dụng trong quy mô công nghiệp nhằm giảm giá thành sản phẩm là một nhu cầu cần thiết. Đó là nguồn nitơ rẻ tiền, dễ kiếm, dễ sử dụng mà vẫn đảm bảo đủ hàm lượng và các loại axit amin cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Có rất nhiều nguồn nitơ thay thế khác nhau như dịch thủy phân từ tôm, cá, sữa đậu nành, dịch nấm men thủy phân...Trong đó dịch nấm men thủy phân dễ kiếm và dễ làm với số lượng lớn. Hơn nữa trong dịch còn chứa nhiều axit amin (16 loại với 8 axit amin không thay thế), đồng thời còn có cả một số chất kích thích sinh trưởng và một số vitamin cần thiết. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn dịch nấm men thủy phân làm nguồn nitơ thay thế. Chủng HA6 được nuôi với các tỷ lệ dịch nấm men thủy phân khác nhau và đảm bảo đúng hàm lượng nitơ tổng có trong môi trường MRS là 2,5g/l ( theo chỉ tiêu của hãng Merck,
Germany), các thành phần còn lại giống môi trường MRS. Tiến hành theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của chủng HA6 trên các hàm lượng dịch nấm men thủy phân trong 24 giờ ở 370C thông qua hàm lượng sinh khối. Khi đó ta có kết quả thể hiện ở hình 3.5.
Hình 3.5:Tốc độ sinh trưởng và phát triển của HA6
trên các hàm lượng dịch nấm men thủy phân khác nhau
Hình 3.5 cho thấy khi phát triển trên các hàm lượng nấm men thủy phân khác nhau, thời điểm thu hồi sinh khối tốt nhất là sau 18 giờ. Từ đó ta thu hồi sinh khối của chủng HA6 và dược kết quả trên hình 3.6.
Hình 3.6: Ảnh hưởng của hàm lượng dịch nấm men thủy phân đến sự phát triển của HA6
Từ hình 3.6 ta thấy: Khi thay thế dịch nấm men thủy phân càng nhiều thì hàm lượng sinh khối và hiệu suất thu hồi sinh khối càng giảm. Nếu không thay thế thì hàm lượng sinh khối đạt 17g/l, nếu thay thế 25% đạt 15,9g/l, thấp nhất là thay thế 100% (đạt 4,6g/l). Điều đó được giải thích do trong dịch nấm men thủy phân tuy có nhiều axit amin nhưng tỷ lệ giữa các loại không cân đối, đồng thời dịch nấm men thủy phân không triệt để nên hàm lượng nitơ amin so với nitơ tổng trong dịch nấm men thủy phân ít, không đủ axit amin cần cho sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn. Nhưng để đảm bảo có thể sản xuất trên quy mô lớn, chúng tôi chọn thay thế 50% dịch nấm men thủy phân vì hàm lượng sinh khối (15g/l) và hiệu suất thu hồi sinh khối (30%) không nhỏ hơn nhiều khi thay thế 25% (15,9g/l và 31,8%).
Như vậy, từ kết quả đạt được, chúng tôi đã rút ra môi trường nuôi cấy mới: nguồn cacbon là sacacroza hàm lượng 40g/l và thay thế 50% dịch nấm men thủy phân. Bây giờ ta tiến hành xét các điều kiện nuôi cấy trên môi trường mới.
III.2.2. Lựa chọn các điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy chủng Lactobacillus
fermentum HA6
III.2.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống
Tỷ lệ tiếp giống ảnh hưởng rất nhiều đến thời gian nuôi cấy và hiệu quả kinh tế. Một tỷ lệ tiếp giống thích hợp sẽ rút ngắn được thời gian nuôi cấy, tạo được lượng sinh khối lớn. Sự ảnh hưởng này được thể hiện ở hình 3.7 và bảng 3.4.
Hình 3.7: Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến sự phát triển của Ha6
Bảng 3.4: Các chỉ tiêu của chủng HA6 khi nuôi ở các tỷ lệ tiếp giống khác nhau
Chỉ tiêu Tỷ lệ tiếp giống (g/l)
1 1,5 2 3 Hàm lượng axit (g/l) 17,1 18,5 19,2 20 Hàm lượng đường sót (g/l) 5,2 4,1 2,2 1,3 Tổn thất (%) 18,1 13,7 12 10,65
Nhìn vào hình 3.7. nhận thấy: Tỷ lệ tiếp giống 2g/l và 3g/l cao hơn so với tỷ lệ tiếp giống 1,5 g/l và 1g/l (36,1g/l và 34,5 g/l so với 29,8g/l và 26.1 g/l). Theo bảng 3.4 tổn thất của tỷ lệ tiếp giống 2g/l ít hơn so với tỷ lệ tiếp giống 1g/l và 1,5 g/l, đồng thời cao hơn của tỷ lệ tiếp giống 3g/l không nhiều. Ta chọn tỷ lệ tiếp giống là 2g/l vì hàm lượng sinh khối, và tổn thất của 3g/l không lớn hơn 2g/l nhiều, và tránh bị tốn giống.
III.2.2.2. Ảnh hưởng của pH đến quá trình nuôi cấy chủng Lactobacillus fermentum
HA6
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, chủng Lactobacillus fermentum HA6 tiêu thụ cơ chất và sinh ra lượng lớn axit làm giảm pH của môi trường. Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH trong suốt quá trình nuôi cấy chúng tôi tiến hành theo dõi trong 24 giờ, cứ sau 4 giờ chỉnh pH tới 6,1 là pH ban đầu. Song song tiến hành một mẫu không điều chỉnh pH để so sánh. Thu được kết quả thể hiện ở hình 3.8 và bảng 3.5.
Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH
đến sự phát triển của chủng L.fermentum HA6
Bảng 3.5: Các chỉ tiêu của chủng HA6 khi nuôi cấy ở chế độ duy trì pH và
không duy trì pH
Chỉ tiêu Chế độ nuôi cấy
Duy trì pH Không duy trì pH
Hàm lượng đường sót (g/l) 1,2 2,2
Tổn thất (%) 8,6 12
Như vậy nuôi cấy duy trì pH tuy hàm lượng sinh khối có tăng nhưng không đáng kể, đồng thời hàm lượng axit sinh ra là nhiều hơn do pH bị chỉnh về ban đầu tạo môi trường thích hợp kích thích vi khuẩn sinh axit. Như vậy, việc duy trì pH chỉ thích hợp với mục đích tạo nhiều axit. Đồng thời, trong một số tài liệu chỉ ra rằng khi nuôi không duy trì pH thì vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt độ tốt hơn trong quá trình sấy phun và chịu pH thấp khi đưa vào trong đường ruột. Do đó, để thu sinh khối, ta tiến hành nuôi cấy không duy trì pH ban đầu.
III.2.2.3. Ảnh hưởng của chế độ thông khí đến quá trình nuôi cấy Lactobacillus
fermentum HA6
Theo tài liệu nghiên cứu, HA6 là vi khuẩn yếm khí tùy tiện. Do vậy, để khảo sát ảnh hưởng của oxy tới tốc độ tăng trưởng của chủng, ta tiến hành nuôi cấy ở hai chế độ khác nhau:
+ Nuôi cấy tĩnh.
+ Nuôi cấy ở chế độ yếm khí 5%CO2. Ta thu được kết quả thể hiện hinh 3.9
Hình 3.9: Ảnh hưởng của chế độ thông khí
đến sự phát triển của chủng L.fermentum HA6
Bảng 3.6: Các chỉ tiêu của chủng HA6 khi nuôi cấy ở
chế độ yếm khí và nuôi tĩnh
Chỉ tiêu Chế độ nuôi cấy
Yếm khí 5% CO2 Nuôi tĩnh
Hàm lượng axit (g/l) 16,8 19,2
Hàm lượng đường sót (g/l) 1,7 2,2
Tổn thất (%) 11,3 12
Với điều kiện yếm khí 5% CO2, vi khuẩn HA6 phát triển rất tốt, thu được hàm lượng sinh khối và hiệu suất thu hồi sinh khối cao hơn nhiều so với chế độ nuôi tĩnh (43,5 g/l so với 34,5 g/l). Đồng thời tổn thất nhỏ hơn, điều này tạo điều kiện tốt cho quá trình nuôi cấy lớn.
Vậy, qua các nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trưởng, phát triển của chủng L.fermentum HA6, chúng tôi đã tìm ra chế độ nuôi cấy thích hợp cho chủng này (ở nhiệt độ 37 0C) như sau:
Chủng được nuôi với tỷ lệ tiếp giống 2g/l , không duy trì pH ban đầu, nuôi trong điều kiện yếm khí 5%CO2.
III.2.3. Động học của quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng L.fermentum HA6
Để khẳng định các kết quả thu được, chúng tôi đã nuôi cấy chủng L.fermentum HA6 trong 26 giờ ở 370C trong môi trường mới: đường sacaroza 40g/l, thay thế 50% dịch nấm men thủy phân, pH ban đầu 6.1, không duy trì pH. kết quả thu được thể hiện trên hình 3.10.
Hình 3.10: Biến thiên của hàm lượng sinh khối, hàm lượng axit và hàm lượng đường tạo ra trong quá trình phát triển của chủng
L.fermentum HA6
Hình 3.10 cho thấy hàm lượng đường giảm và hàm lượng sinh khối và axit của vi khuẩn tăng trong quá trình lên men. Lượng sinh khối đạt cực đại sau 18 giờ nuôi cấy, và có thể đạt 43,2 g/l. Điều này khẳng định rằng đã tìm được môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình tạo sinh khối của chủng L. fermentum HA6 phù hợp với điều kiện của Việt Nam.