Tạo rễ là khâu cuối cùng trong nuôi cấy in vitro và có ý nghĩa quan trọng đối với kỹ thuật chuyển gen ở thực vật. Những nghiên cứu về tái sinh và chuyển gen trên cây thuốc lá ghi nhận IBA, NAA và IAA là những hormone sinh trƣởng đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu tạo rễ. Nồng độ các chất điều khiển sinh trƣởng dao động trong khoảng 0,1 mg/l. Vẫn tiếp tục lặp lại qui trình tái sinh thuốc lá đã công bố của Vân và cs, môi trƣờng MS bổ sung 0,1mg/l NAA đƣợc thử nghiệm tạo rễ thuốc lá C9-1 in vitro. Cụm chồi 4 tuần tuổi có chiều cao 1cm đƣợc tách nhỏ và chuyển sang môi trƣờng tạo rễ. Sau 4-5 tuần, quan sát thấy rễ xuất hiện ở hầu hết các chồi, tỷ lệ gần 90% (bảng 3.3). Các chồi đều phát triển xanh tốt và tạo nhiều lá mới. Quan sát thấy các chồi không chuyển gen trên môi trƣờng đối chứng cũng có quá trình tạo rễ tƣơng tự.
33
Bảng 3.3. Tỷ lệ chồi ra rễ trên môi trường RM
Lô thí nghiệm Số chồi cấy trên môi trƣờng ra rễ
Số chồi ra rễ Tỷ lệ (%)
pCB-GUS 63± 7,07 55± 8,4 87.1± 1,9
WT1 0 0 0
WT2 12± 1,4 10,5± 0,7 87,7± 4,4
Ghi chú: WT1: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường có bổ sung kháng sinh , WT2: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường không bổ sung kháng sinh
Khi các cây in vitro đạt chiều cao từ 5- 7 cm tiến hành đƣa ra ngoài bầu đất. Giá thể thích hợp là 50% trấu, 50% cát. Hai loại giá thể này có độ xốp tốt tuy nhiên khả năng giữ nƣớc kém vì vậy phải chú ý việc chăm sóc tƣới nƣớc cho cây. Chăm sóc khoảng 2 tuần trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Khi cây non có bộ rễ hoàn chỉnh đƣợc chuyển từ giá thể cát, trấu sang trồng trên giá thể với thành phần chủ yếu là đất đất phù sa trong điều kiện nhà lƣới. Từ những kết quả trên, chúng tôi đề ra quy trình chuyển gen và tái sinh cây thuốc lá (giống C9-1) nhƣ sau:
- Mảnh lá bánh tẻ kích thƣớc 0,5cm2 đƣợc ngâm trong dịch huyền phù
Agrobacterium (OD600=0.7-1) trong 30 phút và đồng nuôi cấy trên môi trƣờng cảm ứng chồi (MS+1mg/lBAP) trong 3 ngày
- Sau 2-3 tuần trên môi trƣờng cảm ứng, chuyển sang môi trƣờng tạo cụm chồi (MS)
- Sau 3-4 tuần, tách các chồi đơn và chuyển sang môi trƣờng ra rễ (MS+0,1mg/l NAA)
- Cây rễ hoàn chỉnh 4-5 tuần tuổi đủ điều kiện để chuyển sang trồng trong bầu trấu-cát (tỷ lệ 1: 1)
34 A B C D E F G H I
Hình 3.1. Kết quả chuyển gen gus vào cây thuốc lá A: Mảnh lá ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn
B: Mảnh lá được đặt trên môi trường cảm ứng C: Mảnh lá bắt đầu cảm ứng sau 10 ngày quan sát
D: Các mảnh lá không biến nạp đặt trên môi truong bổ sung kháng sinh vàng dần và chết
E: Cụm chồi xuất hiện trên môi trường chọn lọc F: Tách chồi chuyển sang môi trường ra rễ
35
G: Cây trồng trong môi trường ra rễ sẵn sàng cho ra bầu H: Cây thuốc lá chuyển gen trồng trong bầu cát: trấu I: Cây trồng trong điều kiện nhà lưới sau 2 tuần