chồi
Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá K326 đã đƣợc Vân và cộng sự [12][13] thiết lập. Theo quy trình này, các lá bánh tẻ đƣợc cắt thành những mảnh có kích thƣớc 1cm2 và đặt lên môi trƣờng tái sinh GM (MS cơ bản,1mg/l BAP, 30g/l glucose,8g/l agar, pH5,8) 2 ngày trƣớc khi biến nạp sau đó đƣợc nuôi cộng sinh với dung dịch huyền phù của Agrobacterium trong 2 ngày và chuyển sang môi trƣờng GM có bổ sung kháng sinh chọn lọc cũng nhƣ kháng sinh diệt khuẩn. Giống thuốc lá C9-1 có lá nhỏ và mảnh hơn giống K326, lặp lại việc đặt các mảnh lá trên môi trƣờng GM trƣớc biến nạp cho hiệu quả tái sinh cây thấp. Do vậy, đối với giống C9-1, các mảnh lá hình vuông kích thƣớc khoảng 0,5 cm2 đƣợc cắt ra từ cây in vitro và ngâm vào dung dịch huyền phù Agrobacterium (OD600=0.7-1) có lắc nhẹ trong 30 phút. Việc giảm kích thƣớc các mảnh lá xuống một nửa đồng thời lắc nhẹ trong
30
dịch huyền phù vi khuẩn làm tăng thể tích tiếp xúc giữa vết thƣơng thực vật và dịch khuẩn, là một trong những biện pháp có thể làm tăng khả năng xâm nhập của vi khuẩn vào trong tế bào thực vật dẫn tới tăng hiệu quả chuyển gen. Sau 30 phút, thấm khô và đặt các mảnh lá vào bình chứa môi trƣờng GM và chuyển sang môi trƣờng GM mới. Do vector pCB-GUS có mang đoạn gen kháng kanamycine, nên các môi trƣờng sau biến nạp đều đƣợc bổ sung 50mg/l kanamycine để chọn lọc các cụm chồi chuyển gen. Trong nghiên cứu này, những kết quả về cụm chồi/cây đề cập đến là những cụm chồi/cây sống sót trên môi trƣờng chọn lọc có chứa kanamycine. Cefotacime (400mg/l) cũng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nhằm loại bỏ vi khuẩn còn sót lại trên các mảnh lá.
Thí nghiệm chuyển gen gus vào cây thuốc lá C9-1 đƣợc lặp lại 2 lần, mỗi lần với 30 mảnh lá nguyên liệu. Sau 10 ngày tại những vết cắt ở các mảnh lá xuất hiện những cụm tế bào cứng, có màu xanh lá ( hình 3.1)
Theo nghiên cứu trƣớc về quá trình tái sinh cây thuốc lá, đây là tiền đề cho việc tái sinh chồi [8][7]. Kinetin là chất điều khiển sinh trƣởng thuộc nhóm cytokine, có tác dụng kích thích tạo và phát triển chồi. Vai trò của kinetin trong tạo chồi đã đƣợc chứng minh trên nhiều đối tƣợng thực vật, ở cả cây một lá mầm và hai lá mầm. Với 30mảnh lá /lần biến nạp (lặp lại thí nghiệm 2 lần) thu đƣợc trung bình 24,5± 2,12 mảnh lá có cảm ứng, đạt tỷ lệ khoảng 81,6± 7,07 (bảng 3.1). Song song với thí nghiệm chuyển gen, thí nghiệm đối chứng đƣợc thiết lập bằng cách đặt các mảnh lá thuốc lá C9-1trực tiếp lên môi trƣờng GM và GM có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn và kháng sinh chọn lọc. Toàn bộ mảnh lá không chuyển gen đƣợc đặt lên môi trƣờng có bổ sung kháng sinh đều vàng dần và chết. Trong số 2x4 mảnh lá đặt lên môi trƣờng cảm ứng không bổ sung kháng sinh có trung bình 3,5 ± 0,7 mảnh lá tạo mô sẹo, đạt tỷ lệ khoảng 87,5± 17,6
31
Bảng 3.1. Kết quả cảm ứng chồi từ mảnh lá
Lô thí nghiệm Số mẫu thí nghiệm
Số mẫu cảm ứng Tỷ lệ (%)
pCB-GUS 2x30 24,5± 2,12 81,6± 7,07
WT1 2x4 0 0
WT2 2x4 3,5 ± 0,7 87,5± 17,6
Ghi chú: WT1: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường có bổ sung kháng sinh , WT2: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường không bổ sung kháng sinh
Sau khoảng 2 tuần, bắt đầu quan sát đƣợc những chồi nhỏ. Tách các chồi nhỏ và cấy trên môi trƣờng MS cơ bản, không bổ sung chất điều khiển sinh trƣởng. Sau 3 tuần, 100% mảnh lá lô không chuyển gen đều thu đƣợc chồi, với tỉ lệ trung bình là 3,4± 0,25 chồi/mảnh lá. Số lƣợng mẫu tạo chồi trung bình ở lô chuyển gen là 3,2± 0,25 với số chồi trung bình 3,2± 0,25 chồi/mảnh lá (bảng 3.2). Nhƣ vậy, không có sự khác biệt đánh kể trên các lô cây chuyển gen và không chuyển gen, chứng tỏ quá trình tái sinh cây thuốc lá thiết lập trong thí nghiệm này có hiệu quả. Trong qui trình tái sinh cây thuốc K326, các mảnh lá sau khi cảm ứng chồi vẫn đƣợc tiếp tục phát triển trên môi trƣờng có bổ sung kinetin 1mg/l. Qui trình tái sinh giống C9-1 ban đầu cũng đƣợc lặp lại tƣơng tự nhƣ giống K326. Trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy ở lô đối chứng không bổ sung kinetin, hiệu quả tạo chồi cao hơn đáng kế. Do vậy, chúng tôi lựa chọn môi trƣờng không có chất điều khiển sinh trƣởng làm môi trƣờng tối ƣu cho phát triển cụm chồi đối với giống C9-1. Điều này có thể giải thích do sự khác biệt về kiểu gen giữa 2 giống thuốc lá, chỉ cần bổ sung một lƣợng nhỏ kinetin (1mg/l) trong thời gian ngắn (2-3 tuần) là thích hợp để kích thích cảm ứng chồi của mô lá thuốc lá C9-1.
32
Bảng 3.2: Kết quả tạo chồi
Lô thí nghiệm Số mẫu thí nghiệm Số mẫu tạo chồi Tỷ lệ (%) Tổng số chồi Số chồi trung bình pCB-GUS 24,5± 2,12 19,5± 0,7 79,75± 4,03 63± 7,07 3,2± 0,25 WT1 0 0 0 0 0 WT2 3,5 ± 0,7 3,5± 0,7 100 12± 1,4 3,4± 0,25
Ghi chú: WT1: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường có bổ sung kháng sinh , WT2: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường không bổ sung kháng sinh