Dùng que đã diệt khuẩn để lấy mẫu (khuẩn lạc) đặt lên lam kính,dàn mỏng Nhỏ dung dịch Violet (màu tím) lên mẫu để 30-60s
Rửa nhanh bằng nước, rảy khô
Nhỏ dung dịch Lugol lên mẫu để 1 phút Rửa nhanh rảy khô
Nghiêng lam kính, nhỏ cồn 96% lên để tẩy màu Rửa nhanh bằng nước, rảy khô
Nhỏ dung dịch Fushin lên mẫu, để 1-2 phút
Rửa nước, rảy khô dùng khăn giấy thấm làm khô tiêu bản
Nhỏ dầu lên tiêu bản, đem soi dưới kính hiển vi (vật kính dầu) nếu mẫu giữ nguyên màu xanh tím là vi khuẩn Gram(+), nếu mẫu chuyển sang màu hồng là vi khuẩn Gram(-).
3.3.2.4. Phương pháp chiết xuất thảo dược
Thảo dược thí nghiệm được rửa sạch, để ráo nước tự nhiên ở nhiệt độ phòng, rồi cho vào máy xay thật nhuyễn, có thể thêm một ít nước cất làm dung môi nhằm thuận tiện cho việc vắt lấy dịch chiết qua lưới lọc. Dịch chiết được bảo quản ở nơi khô thoáng với nhiệt độ luôn bảo đảm dưới 500C tránh hiện tượng tác dụng dược lý của thảo dược bị mất đi bởi nhiệt độ.
3.3.2.5. Phương pháp thử khả năng kháng khuẩn của thảo dược
Tiến hành thử nghiệm dịch chiết thảo dược trên vi khuẩn phân lập được theo phương pháp thạch lỗ của Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội, 1998. Các thao tác thực hiện trong điều kiện vô trùng bằng tủ cấy vô trùng.
Phương pháp tiến hành: Lấy 0,1ml dung dịch ở ống nghiệm chứa vi khuẩn có mật độ 106CFU/ml dàn đều trên mặt thạch bằng que gạt, để khoảng 5 phút cho bề mặt thạch khô tự nhiên. Mỗi đĩa thạch đục 5 lỗ trên mặt thạch với đường kính 3mm/lỗ (mỗi
Sơ đồ bố trí thí nghiệm khả năng kháng khuẩn của mỗi loại thảo dược
I1 II1 III1
I2 II2 III2
I3 II3 III3
Giải thích:
I1, I2, I3:công thức thí nghiệm I, II, III: loai thảo dược thử nghiệm 1, 2, 3: số lần lặp lại
3.3.2.6. Phương pháp sàng lọc nồng độ
Thí nghiệm được bố trí trên 24 giếng nhựa chứa 2 ml pepton với các nồng độ dịch chiết thảo dược pha loãng 10 lần và được lặp lại 3 lần. Khối thạch có vi khuẩn phát triển trên đó được cắt bằng dụng cụ chuyên dụng với đường kính 5,5 mm sau đó được cho vào trong các giếng, ngâm trong 24h. Các khối thạch sau khi ngâm trong các giếng được đưa vào nuôi cấy ở các đĩa thạch NA + 2% NaCl. Xem xét khả năng phát triển của khuẩn lạc sau 1 ngày, 2 ngày và 7 ngày.
Nghiệm thức đối chứng âm không bổ sung dịch chiết thảo dược vào môi trương nuôi cấy. Nghiệm thức đối chứng dương bổ sung 2 ml nước cất trong môi trường pepton.
3.3.2.7. Phương pháp xác định nồng độ ức chế
Từ kết quả thí nghiệm thứ nhất, nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu sẽ được thử nghiệm ở thí nghiệm thứ hai với thí nghiệm được bố trí như thí nghiệm đầu tiên nhưng nồng độ dịch chiết thảo dược sẽ được pha loãng 2 lần trong các nghiệm thức. Các nghiệm thức đối chứng không bổ sung dịch chiết thảo dược. Sau 1 ngày, 2 ngày và 7 ngày kiểm tra sự phát triển của khuẩn lạc. Nuôi cấy trong môi trường NA + 2% NaCl ở nhiệt độ 300C.
3.3.2.8. Phương pháp xác định nồng độ tiêu diệt vi khuẩn
Các khối thạch có vi khuẩn phát triển trên đó được ngâm trong các môi trường có chứa các nồng độ dịch chiết thảo dược khác nhau trong 15 phút, 30 phút, 1 giờ và 24 giờ. Sau đó được rửa sạch 3 lần với nước cất và nuôi cấy trong môi trường NA + 2% NaCl.
Xác định khả năng tiêu diệt vi khẩn của dịch chiết thảo dược bằng cách so sánh sự phát triển của khuẩn lạc trong môi trường thạch ở các nghiệm thức có bổ sung dịch chiết thảo dược với các nghiệm thức đối chứng là các khối thạch được ngâm trong nước cất. Nếu khuẩn lạc không phát triển thì tiếp tục theo dõi đến ngày thứ 3.
3.4. Phương pháp xử lý số liệu 3.4.1. Giá trị trung bình X = n Xi n i ∑ =0 Trong đó: X : Giá trị trung bình Xi : Giá trị của mỗi lần đo n : Số lần đo 3.4.2. Độ lệch chuẩn n X Xi ∑ − = 2 ) ( σ Trong đó: X : Giá trị trung bình σ : Độ lệch chuẩn n: Số lần đếm
Xi: Giá trị trung bình
3.4.3. Công thức tính mật độ vi khuẩn
X = VA.K
Trong đó: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
X: mật độ vi khuẩn
A: Số lượng khuẩn lạc trung bình trong 1 độ pha loãng V: Thể nước đưa vào nuôi cấy
K: Hệ số pha loãng
3.4.4. Xử lý số liệu
4.1. Đặc điểm chung của mẫu tôm
Mẫu được chọn là tôm sú giống (từ Post15 đến Post33). Mẫu được thu theo phương pháp ngẫu nhiên, mỗi đợt thu khoảng 30 mẫu. Quan sát thấy mẫu có kích cỡ đồng đều (1 - 2 cm), hoạt động nhanh nhạy, không có hiện tượng phân đàn...
4.2. Kết quả phân lập, định danh vi khuẩn
Kết quả phân lập vi khuẩn từ những mẫu tôm được thể hiện ở bảng 4.1 sau:
Bảng 4.1. Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn trên tôm sú giống
Đặc điểm sinh hoá Kết quả
Chủng 1 Chủng 2
Hình dạng khuẩn lạc Tròn to, không đều Tròn nhỏ, đều
Màu sắc khuẩn lạc Xanh Vàng
Kích thước khuẩn lạc (mm) 3,2 - 3,9 1,4 - 1,8
Hình dạng tế bào Hình que Hình que
Đặc điểm khuyếch tán môi trường nuôi cấyKhông làm biến đổi
Làm biến đổi màu của môi trường
nuôi cấy
Kết quả nhuộm Gram - -
Acid hoá Glucose + +
Acid hoá Lactose + +
Acid hoá Sacarose - +
Phản ứng Methylred + -
Phản ứng KIA +/+ +/+
Phản ứng Citrat - -
Sinh hơi từ Glucose + -
α – Naptol - -
Indol + +
Phản ứng MR – VP - -
Khả năng di động Không di động Không di động (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khả năng sinh H2S - -
Kết luận V. harveyi V. alginolyticus
Kết quả phân lập được 2 chủng vi khuẩn Vibrio harveyi, và Vibrio alginolyticus
từ các mẫu tôm thu được. Đây là 2 loài vi khuẩn Gram (-) (Hình 4.1 và 4.2), tế bào có dạng hình que ngắn, không có khả năng di động, phát triển trên môi rường thạch chọn lọc TCBS, cho khuẩn lạc màu rõ rệt: màu xanh của V.harveyi (Hình 4.3), và màu vàng
Theo Bùi Quang Tề (2002) các loài vi khuẩn Vibrio là những loài gây ra bệnh chủ yếu trên tôm như: bệnh đỏ dọc thân, bệnh ăn mòn vỏ giáp xác, bệnh mềm vỏ... Những vi khuẩn này thường là những tác nhân cơ hội, khi tôm sốc do môi trường biến đổi, hoặc bị nhiễm các bệnh khác như virus, nấm, kí sinh trùng. Khi sức đề kháng của động vật thuỷ sản giảm, các loài vi khuẩn Vibrio có khả năng gây bệnh nặng và gây chết hàng loạt.
Vibrio harveyi thường phân bố trong nước biển, ven bờ... gây bệnh cho giáp xác, đặc biệtlà
.
Hình 4.1. Vibrio harveyi
Hình 4.2: Vibrio alginolyticus
Hình 4.3. Khuẩn lạc của V. harveyi trên môi trường TCBS
Theo Đỗ Thị Hòa (2004), có sự khác nhau về sự khuếch tán màu sắc trên môi trường TCBS của hai chủng vi khuẩn này do khác nhau về khả năng lên men loại đường Saccarose. Vi khuẩn V.alginolyticus có khả năng lên men đường Saccarose và làm thay đổi màu sắc của môi trường từ màu xanh sang màu vàng (Hình 4.4). Trong khi đó, vi khuẩn V. harveyi không có khả năng lên men loại đường này nên không làm thay đổi màu sắc của môi trường (Hình 4.3).
4.3. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại dịch chiết thảo dược
Thí nghiệm thử khả năng kháng khuẩn của các công thức dịch chiết thảo dược khác nhau được tiến hành trên cả hai chủng vi khuẩn V.alginolyticus và V.harveyi.
Các thí nghiệm được tiến hành đối với vi khuẩn nuôi cấy ở mật độ 106 CFU/ml. Thảo dược thử nghiệm ở 4 nồng độ: 106, 105, 104, 103. Qua kết quả thử nghiệm thảo dược ở nồng độ 104, 105, 106, tất cả các thảo dược đều có tác dụng kháng khuẩn (có vòng kháng khuẩn rõ ràng). Riêng ở nồng độ 103, diếp cá không có tác dụng kháng khuẩn (vi khuẩn mọc tràn đĩa).
4.3.1. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với các chủng vi khuẩn phân lập được
Kết quả thử nghiệm tác dụng của tỏi lên sự phát triển V.alginolyticus, V.harveyi
được thể hiện ở đồ thị 4.1 và đồ thị 4.2.
Đối với vi khuẩn V.alginolyticus, kết quả từ đồ thị 4.1 cho thấy tỏi ở 4 nồng độ:
Đồ thị 4.2. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với V.harveyi
(a, b, c, d: thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) a b d c a d c b
Đồ thị 4.1. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với V.alginolyticus
Hình 4.5. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của tỏi khi thử nghiệm trên V.alginolyticus
Đối với vi khuẩn Vibrio harveyi, đồ thị 4.2 chỉ rõ, tỏi nguyên chất và tỏi pha loãng 105, 104, 103 đều có khả năng kháng khuẩn. Tỏi ở các nồng độ khác nhau cho khả năng kháng khuẩn khác nhau. Tỏi nguyên chất có khả năng kháng khuẩn tốt nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 23.7 ± 1.18 mm, tỏi 105, 104 kháng khuẩn kém hơn với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn tương ứng là 19.9 ± 1.26 mm, 15 ± 0.7 mm, thấp nhất ở tỏi nồng độ 103 với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 11.17 ± 1.27 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (p = 0.02, 0.004, 0.01).
Mức độ kháng khuẩn của thảo dược được quyết định bởi thành phần, tính chất của các hợp chất được chiết xuất. Theo Đỗ Tất Lợi, 2004, trong tỏi có một ít iốt và tinh dầu. Thành phần kháng khuẩn chủ yếu của tỏi là chất lixin (C6H10OS2), alixin là một hợp chất có tác dụng diệt khuẩn mạnh, phổ diệt khuẩn rộng với nhiều loại vi khuẩn. Ở động vật thủy sản, alixin có tác dụng rất tốt với các vi khuẩn gây bệnh gram (-). Trong tỏi tươi không có chất alixin, nó chỉ hình thành khi củ tỏi được phơi khô. Trong tỏi tươi, chứa chất aliin - đây là một acide amin, dưới tác dụng của men alinaza có trong tỏi để tạo nên alixin.
Hình 4.6. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của tỏi khi thử
Chất alixin tinh khiết là một chất dầu không màu, hòa tan trong cồn, benzen, ete, không ổn định trong nước, dễ thủy phân, độ thủy phân 2 - 5%. Điều này giải thích vì sao tỏi nồng độ 105, 104, 103 có tác dụng kháng khuẩn kém hơn tỏi nguyên chất.
Chất alixin bị nhiệt sẽ chóng mất tác dụng, gặp kiềm cũng bị mất tác dụng. Để ở nhiệt độ mát trong phòng, sau 2 ngày, chất alixin không còn tác dụng diệt trùng, gặp môi trường kiềm cũng biến chất, nhưng trong môi trường acid yếu không bị ảnh hưởng. Chất alixin rất dễ mất oxy do đó mất tác dụng kháng sinh, vì vậy nhiều tác giả đã cho rằng tác dụng kháng sinh của alixin chủ yếu do oxy trong phân tử. Nồng độ alixin trong dung dịch từ 1/50.000 - 1/25.000 có khả năng diệt trùng do oxy nguyên tử của alixin quyết định. Alixin rất dễ kết hợp với một acid amin gốc SH là Cystein của tế bào vi khuẩn, để tạo thành hợp chất mới, làm vi khuẩn hết khả năng sinh sản, sau đó bị tiêu diệt.
4.3.2. Khả năng kháng khuẩn của chó đẻ răng cưa đối với các chủng vi khuẩn phân lập được (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả thử nghiệm tác dụng của chó đẻ răng cưa lên sự phát triển của V.alginolyticus,
V.harveyi được thể hiện ở đồ thị 4.3 và đồ thị 4.4.
Kết quả từ đồ thị 4.3 chỉ rõ đối
Đồ thị 4.3. Khả năng kháng khuẩn của chó đẻ răng cưa đối
với V.alginolyticus
(a, b, c: thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) b a c b a b c d
Hình 4.7. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của chó đẻ răng cưa khi thử nghiệm trên V.alginolyticus
us, chó đẻ răng cưa ở 4 nồng độ đều có khả năng kháng khuẩn. Chó đẻ răng cưa nồng độ 106 có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 20.2 ± 0.93 mm, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p = 0.042 (p < 0.05). Chó đẻ răng cưa nồng độ 105 hiệu quả kháng khuẩn cao hơn chó đẻ răng cưa nồng độ 104. Tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa về thống kê (p = 0,10 > 0,05). Hay nói cách khác khả năng kháng khuẩn của chó đẻ răng cưa nồng độ 105 tương đương với chó đẻ răng cưa nồng độ 104. Nhưng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về khả năng kháng khuẩn của chó đẻ răng cưa nồng độ 105 và 104 với p = 0.007.
Đối với vi khuẩn V.harveyi, qua đồ thị 4.4 cho thấy chó đẻ răng cưa ở 4 nồng độ đều có khả năng kháng khuẩn. Chó đẻ răng cưa nồng độ 106 có khả năng kháng khuẩn cao nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 19.3 ± 0.86 mm, kém nhất chó đẻ răng cưa nồng độ 10ˆ3 với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 7.3 ± 0.29 mm. Sự khác biệt giữa hai nồng độ chó đẻ răng cưa 106 và 105 có ý nghĩa thống kê (p = 0.006 < 0,05). Khả năng kháng khuẩn của chó đẻ răng cưa nồng độ 105 kém hơn chó đẻ răng cưa nồng độ 106 nhưng tốt hơn chó đẻ răng cưa nồng độ 104, 103, sự khác biệt giữa nồng độ này với hai nồng độ còn lại (104, 103) có ý nghĩa về thống kê (tương ứng p = 0.016, 0.023 < 0,05).
Trong chó đẻ răng cưa có chứa các chất phyllanthin (C24H34O6), hypophyllanthin (C24H30O7), niranthin (C24H32O7), nirtetralin (C24H30O7), phylteralin (C24H34O6). Đây đều là những chất có tính kháng vi sinh vật rất cao.
Trong phòng trị bệnh ở động vật thuỷ sản, đã thử tác dụng diệt khuẩn của dịch chiết rút từ cây chó đẻ răng cưa với vi khuẩn Aeromonas hydrophyla, Edwardsiella tarda gây bệnh hoại tử ở cá trê, kết quả cho vòng kháng khuẩn khá lớn 11 - 20 mm (Bộ môn bệnh cá viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I, 1993). Một số nghiên cứu khác ở Việt Nam, bằng phương pháp đào rãnh cho thấy, dịch chiết rút từ cây chó đẻ răng cưa có khả năng diệt khuẩn cao với một số vi khuẩn gây bệnh ở tôm và cá như: Vibrio parahaemolyticus,
V.alginolyticus và Aeromonas hydrophyla, đường kính vòng kháng khuẩn 18 - 20 mm
khi chiết rút với dung môi là cồn (Đỗ Thị Hòa và ctv, 1998).
Năm 1992, Sataporn Direkbusarakom đã thử nghiệm dùng dịch chiết rút từ cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus spp) để ngăn chặn sự bùng phát bệnh virus đầu vàng (YHD) ở tôm sú, cho kết quả rất khả quan. Những lô thí nghiệm có dịch chiết từ 2 loại
Phyllanthus amarus và P.urinarria tôm vẫn sống và khỏe mạnh 80 - 100%, trong khi
các lô đối chứng tôm chết 100% sau một ngày thí nghiệm.
4.3.3. Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với các chủng vi khuẩn phân lập được
Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với các chủng vi khuẩn phân lập được thể hiện qua bảng 4.2 và 4.3.
Nồng độ thảo dược (ppm) Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)MS ± SD 1000000 10.9 ± 0.91a 100000 8.9 ± 0.21b 10000 5.0 ± 4.38b 1000 0.0 ± 0.00b
(a, b: thể hiện sự khác biệt thống kê với p<0,05)
Nồng độ thảo dược (ppm) Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) MS ± SD 1000000 9.2 ± 0.92a 100000 7.9 ± 0.58a 10000 6.3 ± 0.12b 1000 0.0 ± 0.00a
Bảng 4.2. Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với V.alginolyticus
nồng độ 106 ppm hiệu quả kháng khuẩn của diếp cá cao hơn với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 10.9 ± 0.91 mm (sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p = 0.02 < 0.05). Ở nồng độ 105, 104 khả năng kháng khuẩn của diếp cá thấp hơn với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn tương ứng 8.9 ± 0.21 mm, 5.0 ± 4.38 mm. Tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê (p = 0.198, 0.118 > 0.05).
Đối với V.harveyi, qua bảng 4.3 thấy rõ diếp cá nồng độ 106, 105, 104 có khả năng kháng khuẩn, diếp cá nồng độ 103 không có tác dụng kháng khuẩn. Diếp cá nồng độ 106 kháng khuẩn mạnh hơn diếp cá nồng độ 105, 104 tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê (p = 0.09 > 0.05). Đường
kính vòng kháng khuẩn trung bình của hai nồng độ 105, 104: 7.9 ± 0.58 mm, 6.3 ± 0.12 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p = 0.009 < 0.05.