Những hợp chất có hai hoặc đa nhóm chức năng như glutaraldehyde, diisocyanate được dùng lăm cầu nối khđu mạch tạo thănh đại phđn tử không tan trong nước. Phương phâp năy thường cho hoạt tính thấp lă do câc hợp chất khđu mạch có thể liín kết văo trung tđm hoạt động của enzyme.
Trín đđy lă một số phương phâp cố định enzyme, sự lựa chon đúng phương phâp thích hợp cho từng enzyme vă vật liệu cố định chuyín biệt lă một yếu tố tối quan trọng để thu được chế phẩm enzyme cố định có hoạt tính cao. Đồng thời cần xâc định câc điều kiện hoạt động thích hợp cho enzyme cố định. Vì vậy để cho quâ trình cố định có kết quả nín lưu ý :
Enzyme phải ổn định trong những điều kiện diễn ra phản ứng.
Câc chất tham gia phản ứng tạo liín kết ngang chủ yếu chỉ tương tâc với những nhóm chức năng nằm ngoăi trung tđm hoạt động enzyme hoặc tạo liín kết ngang có kích thước lớn không cho phĩp nó xđm nhập văo trung tđm hoạt động enzyme.
Trung tđm hoạt động phải luôn được “bảo vệ” bằng nhiều phương phâp khâc nhau như : Enzyme chứa nhóm SH thì cần phải xử lý sơ bộ nó bằng glutathinon hay cystein vă chỉ tâi hoạt hóa enzyme sau khi đê gắn nó văo vật
liệu cố định hoặc bổ sung văo hỗn hợp phản ứng cơ chất đê được bêo hòa bởi enzyme.
Cần chọn biện phâp thích hợp để tâch “enzyme không được gắn” lín vật liệu cố định, mă không gđy ảnh hưởng xấu đến enzyme được gắn.
Khi lựa chọn hệ cố định cần để ý đến phản ứng cụ thể vă thật vô nghĩa nếu đưa enzyme văo vật liệu cố định mă bản chất vật liệu cố định lă polymer bị phđn giải bởi enzyme năy xúc tâc hoặc đặc biệt nếu enzyme bị ức chế bởi sản phẩm của phản ứng tạo ra.
2.3. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH[3]
2.3.1.Trong công nghiệp
Ngăy nay, nhiều qui trình ứng dụng enzyme cố định trong công nghiệp như công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khât, chế biến sữa, sản xuất da, hóa chất.
Rượu bia : câc enzyme amylase, tế băo nấm men cố định enzyme được sử dụng với qui mô lớn.
Chế biến sữa : Enzyme lactase cố định để thủy phđn lactose trong sữa. Năm 1969 Wilson đê sản xuất liín tục glucose bằng glucoamylase cố định. Năm 1971 đê dùng chymotrysin liín kết cộng hóa trị với carboximethyl cellulase lăm đông tụ sữa thay cho renin đắt tiền.
Thu nhận hỗn hợp glucose fructose
Năm 1973 hêng Clinton Corn (Mỹ) đưa văo sản xuất công nghiệp glucoisomerase chuyển hóa glucose thănh fructose với tỉ lệ 1:1, thông thường được gắn với câc polymer vô cơ qua câc liín kết đồng hóa trị.
Tâch hỗn hợp aminoacid nhờ aminocylase
Công trình được sử dụng đầu tiín ở Nhật Bản để sản xuất methionine. Hêng Snam Progetti (Ý) nhốt aminoacid trong sợi cellulose triacetat.
Hêng Tanaka Cuaky (Nhật) sử dụng phương phâp hấp thụ aminoacid trín DEAE Cellulose.
Thu nhận l asparric acid
Aspartase cố định xúc tâc quâ trình gắn nhóm NH3 văo fumaric acid để nhận được L aspartic acid (1973) hiệu suất chuyển hóa lâ 80%. Aspartic cố định thu nhận bằng câch nhốt tế băo trong gel polyacrylamide.
Thu nhận l succinic acid
Fumarase cố định chuyển hóa fumaric acid thănh L succinic acid được thực hiện ở qui mô công nghiệp năm 1974, phản ứng xảy ra cho đến khi 80% fumaric acid được chuyển hóa. Fumarase cố định được thu nhận bằng câch nhốt tế băo trong gel polyacrylamide hoặc sợi triacetate cellulose.
Thu nhận 6 amino penicillinic acid
6 APA lă bân sản xuất để tổng hợp câc loại penicilin khâc nhau, lần đầu tiín được hêng Snam Progetti 1975 đê sử dụng penicillinamiolase cố định để sản xuất penicillin.
Thủy giải lactose
Lactose hay còn gọi lă “đường sữa” có độ ngọt vă độ hòa tan thấp, bị thủy giải bởi lactase thănh glucose vă galactose.
Câc chế phẩm lactase cố định đê được chế tạo theo phương phâp khâc nhau: nhốt trong sợi triacetate cellulose, liín kết đồng hóa trị với câc polymer chứa silic, hấp thụ trín câc chất trao đổi ion.
Thu nhận từ tinh bột
Để thu nhận glucose phải sử dụng hai enzyme lă amylase vă glucoamylase phđn cắt tinh bột thănh câc oligosaccharide, còn glucoamylase phđn cắt tinh bột vă tạo thănh glucose. Hiện nay người ta chú ý tạo glucoamylase cố định.
Hêng Corning Glass đê sử dụng glucoamylase cố định để sản xuất 450 kg glucose/ngăy. Chế phẩm glucoamylase cố định được thu nhận bằng câch gắn enzyme trín silicagel, nhốt trong sợi triacetate cellulose hấp thụ trín DEAE Cellulose.
Ngoăi ra, hiện nay vô số enzyme đắt tiền khâc đang được tiến hănh cố định vă nghiín cứu sử dụng ở qui mô công nghiệp.
2.3.2.Trong y học
Enzyme cố định được ứng dụng nhiều trong y học, để chữa câc bệnh di truyền do thiếu enzyme hoặc hoạt độ enzyme yếu. Năm 1954 Chung đê tạo được vi tiểu cầu bân thấm có gắn enzyme, nhờ thế enzyme có thể tồn tại trín cơ thể lđu dăi vì enzyme bị biệt lập với môi trường xung quanh. Nhờ thế mă cơ thể tạo được nồng độ cao của enzyme thiếu mă không bị ảnh hưởng đến câc phản ứng phụ.
Urease cố định được dùng để loại urea trong mâu của thận nhđn tạo. Câc tiểu cầu có gắn catalase dùng trị thiếu catalase cơ.
Enzyme cố định còn được dùng trong chẩn đoân bệnh, ngoăi câc ứng dụng điện cực enzyme, trong phđn tích câc chỉ tiíu sinh hóa của mâu như lượng glucose, urea, cholesterol… enzyme horse radish peroxidase cố định trín polystyren cùng với khâng thể giúp chẩn đoân nhanh vă chính xâc (kỹ thuật ELLISA).
Enzyme 1 asparaginase có khả năng ức chế sự phât triển của khối u âc tính, nếu đưa trực tiếp enzyme năy văo cơ thể thì bị đưa ra ngoăi nhanh chóng vă gđy hiện tượng dị ứng, nhưng nếu đưa câc vi tiểu cầu có gắn enzyme văo cơ thể sẽ có hiệu quả hơn.
2.3.3.Trong nghiín cứu khoa học
Trước tiín enzyme cố định lă công cụ nghiín cứu hóa sinh rất quan trọng. Năm 1967, điện cực enzyme đầu tiín đê được chế tạo để xâc định nồng độ glucose nhờ glucooxydase cố định. Điện cực enzyme lă điện cực oxy trín bề mặt có gel poly acrylamide. Nhúng điện cực văo dung dịch có glucose thì cơ chất vă oxy sẽ khuếch tân văo gel chứa enzyme. Như vậy, sự biến đổi dòng điện trong hệ thống điện cực phụ thuộc văo tốc độ của phản ứng vă nồng độ glucose.
Kaetsu đê dùng điện cực urease để đo nồng độ urea trong mâu, dùng cholesterol oxidase đo nồng độ cholesterol.
Clark dùng điện cực alcohol oxydoreductase để xâc định nồng độ cồn. Ngoăi ra enzyme còn có thể dùng văo nhiều mục đích khâc nhau như: hoạt hóa zymogen, nghiín cứu cấu trúc phđn tử protein, sử dụng phương phâp sắc ký âi lực để tinh chế một số chất có khả năng liín kết đặc biệt với enzyme. Ngăy nay có nhiều qui trình sử dụng chế phẩm tế băo cố định để xử lý nước thải đạt hiệu quả.
Câc nghiín cứu về măng enzyme cố định ngăy căng tăng, những kết quả đạt được cũng phụ thuộc nhiều văo tính chất của măng dùng để gắn enzyme.
Trín cơ sở nghiín cứu tính chất của enzyme cố định sẽ góp phần giải quyết nhiều vấn đề lớn khâc nhau như :
– Giải thích toăn diện hơn chức năng xúc tâc sinh học trong tế băo sống vă điều hòa hoạt động enzyme trong tế băo.
– Điều hòa tính thấm của măng vă khuếch tân qua măng.
– Đặc tính của phản ứng enzyme ở giới hạn phđn câch giữa câc phase của măng, trong môi trường kỵ nước, môi trường nước trong măng tế băo.
Ngăy nay, việc nghiín cứu enzyme cố định được tiến hănh theo hướng ngăy căng phức tạp dần, mô hình từ một enzyme riíng lẻ đến hệ thống nhiều enzyme, sẽ tiến đến tạo những cấu trúc trín phđn tử có trật tự bao gồm nhiều phức hệ enzyme. Nghiín cứu quâ trình xúc tâc nhờ câc hệ thống phức tạp sẽ giúp hiều biết đầy đủ cơ chế câc quâ trình trao đổi chất của tế băo.
2.4. CÂC NGHIÍN CỨU VỀ ENZYME CỐ ĐỊNH 2.4.1.Câc nghiín cứu trong nước 2.4.1.Câc nghiín cứu trong nước
Việc nghiín cứu vă ứng dụng enzyme cố định ở Việt Nam chưa phổ biến lắm vă vẫn còn được xem lă hướng mới mẻ, kết quả thu được còn hạn chế.
Tuy nhiín, gần đđy đê có một số cuộc thử nghiệm về vấn đề cố định enzyme ở tế băo vi sinh, enzyme trích từ động vật, thực vật trong đó nổi bật lă :
Nhóm nghiín cứu của GS TS Nguyễn Văn Uyển thử nghiệm sản xuất cồn bằng kỹ thuật cố định tế băo nấm men Saccharomyces Cerevisiae trín gel calcium alginate. Phương phâp năy không đòi hỏi thiết bị phức tạp vă có thể thực hiện nhanh chóng. Ưu điểm phương phâp sản xuất liín tục nín năng suất tạo cồn tăng, ít đầu tư vốn, nấm men hoạt động liín tục (100 ngăy) thay vì phải cấy vă nhđn giống hăng ngăy nếu theo qui trình cũ.