3.4.6.1 Phương pháp
Định lượng Clostridium Perfringens theo ISO 7937 – 1997 – 04 -15trong thực phẩm và thức ăn gia súc.
3.4.6.2 Phạm vi áp dụng
Định lượng Clostridium Perfringens trong thực phẩm và thức ăn gia súc.
3.4.6.3 Thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị và dụng cụ vi sinh thơng thường đã tiệt trùng.
3.4.6.4 Mơi trường và thuốc thử
- Egg yolk free tryptose sulfite cycloserine agar (SC) – Mơi trường này đã từng được gọi là EY – free TSC
- Fluid thioglycollate medium - Lactose sulfite medium (LS)
3.4.6.5 Quy trình phân tích
- Cấy 1ml dịch mẫu nguyên hoặc đã được pha lỗng thích hợp vào một đĩa petri vơ trùng. Đổ 10ml – 15ml mơi trường SC agar đã được ủ 470C vào đĩa, lắc đều. Sau khi mơi trường đã đơng, đổ thêm lên trên bề mặt khoảng 15ml SC agar. Đĩa đã cấy mẫu được ủ ở 350C hoặc 370C trong 20h ± 2h trong bình kỵ khí.
- Thực hiện lặp lại 2 lần cho mỗi độ pha lỗng.
- Sau khi ủ, khuẩn lạc Clostridium Perfringens trên mơi trường SC agar cĩ màu đen. Giữ lại các đĩa cĩ số khuẩn lạc nhỏ hơn 150, chọn 5 khuẩn lạc điển hình. Nếu số khuẩn lạc điển hình trên mỗi đĩa nhỏ hơn 5 thì chọn tất cả để tiến hành thử nghiệm sinh hĩa.
- Cấy từng khuẩn lạc chọn lọc vào trong ống nghiệm chứa 10ml mơi trường fluid thioglycollate. Ủ trong điều kiện kỵ khí ở 350C hoặc 370C trong 18h đến 24h. Sau khi ủ, dùng pippet vơ trùng cấy 5 giọt dịch canh trùng từ mơi trường fluid thioglycollate sang ống nghiệm chứa 8ml mơi trường LS cĩ ống Durham lật úp.
Cơng Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát
- Kết quả được xem là dương tính nếu mơi trường chuyển thành màu đen và khí
- Sinh ra phải lớn hơn ¼ chiều cao ống Durham.
3.4.6.6 Tính kết quả
3.4.6.6.1 Tính số khuẩn lạc C. perfringens trên mỗi đĩa theo cơng thức sau:
Trong đĩ:
b: số khuẩn lạc C.perfringens cho thử nghiệm dương tính
A: số khuẩn lạc C.perfringens được chọn để tiến hành thử nghiệm C: số khuẩn lạc đặc trưng được đánh dấu trên đĩa.
3.4.6.6.2 Phương pháp tính:
3.4.6.6.2.1 Những đĩa chứa từ 10 đến 150 khuẩn lạc C. perfringens
Trong đĩ:
∑a: tổng số khuẩn lạc C.perfringens trên tất cả các đĩa ở hai nồng độ pha lỗng liên tiếp.
n1: số đĩa được đếm ở độ pha lỗng thứ nhất. n2: số đĩa được đếm ở độ pha lỗng thứ hai
d: hệ số pha lỗng tương ứng với độ pha lỗng thứ nhất N: số khuẩn lạc C.perfringens trong 1g hoặc 1ml mẫu
Cơng Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát