6 PHÂN LOẠI CHỦNG NẤM SỢI FNA1 BẰNG PHƢƠNG PHÁP SO SÁNH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN MÃ HÓA 18S rRNA
6.3 Tách dòng gen 18S rRNA trong vectơ pTZ57R/T
Sau khi thu đƣợc sản phẩm PCR, tiến hành gắn vào vectơ pTZ57R/T nhờ enzym T4 ligase, và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli. Sau khi nuôi
tĩnh qua đêm ở 37oC, trên đĩa biến nạp xuất hiện các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh xen kẽ (Hình 3.30). Một số khuẩn lạc trắng đƣợc lựa chọn để tiến hành tách DNA plasmid. Sản phẩm DNA plasmid thu đƣợc ở các dòng chọn lựa đƣợc điện di kiểm tra trên gel agaroza 1% (Hình 3.31), mẫu DNA plasmid ở các kênh 1, 3 nằm ở vị trí cao hơn so với mẫu đối chứng có khả năng mang sản phẩm mong muốn.
Để kiểm tra dòng plasmid lựa chọn có mang sản phẩm mong muốn hay không, phản ứng PCR kiểm tra có sử dụng khuôn là DNA plasmid của các dòng 1, 3 đã đƣợc thực hiện. Tại các kênh 1, 2 hình 3.32 xuất hiện băng DNA có kích thƣớc khoảng 550bp, vậy có thể các dòng này đã mang sản phẩm PCR mong muốn. Hai dòng này đã đƣợc lựa chọn để tách và làm sạch DNA plasmid với số lƣợng lớn phục vụ cho việc xác định trình tự (Hình 3.33).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
90
Hình 3.30 Khuẩn lạc vi khuẩn E. coli trên môi trƣờng LB chứa X-Gal sau khi biến nạp vector pTZ57R/T C 1 2 3 Hình 3.31 Phổ điện di sản phẩm tách DNA plasmit
Kênh C: Đối chứng (khuẩn lạc màu xanh)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 91 M 1 2
Hình 3.32 Sản phẩm PCR từ DNA plasmit với cặp mồi EF4f và fung5r
Kênh M: Marker 1kb
Kênh 1, 2: Sản phẩm PCR kiểm tra dòng 1 và 3
1 2 C
Hình 3.33 DNA plasmit mang gen 18S rRNA của chủng FNA1
Kênh 1, 2: DNA plasmit sau khi làm sạch Kênh C: Đối chứng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
92