2.1. Nguyên vật liệu
- Các chủng NS phân lập từ mẫu đất, thân, lá cây tại 5 xã của RNM Cần Giờ
- Các VSV kiểm định: E. coli, B. subtilis từ viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh
- Chế phẩm amylase từ viện Sinh học nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh
- Nguồn nguyên liệu thu nhận enzym: Cám mì, trấu, bột ngơ, đậu tương mua từ chợ Tân
Bình.
Các mơi trường sử dụng trong thí nghiệm
* MT1 - MT Czapek – Dox cải tiến: dùng để phân lập NS [9], [22], [43]
NaNO3 3.5g; KH2PO4 1.5g; MgSO4.7H2O 0.5g; KCl 0.5g; FeSO4.7H2O 0.01g (vết); glucose
20g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 6.5; khử trùng 1atm/ 30 phút; Cloramphenicol 1% MT. *MT2 - MT cao nấm men (YEA) (Yeast Extraxt Agar) Dùng để nuơi cấy và giữ giống NS [15] , [54]
Cao nấm men 4g; glucose 20g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 5.5 – 6.0; khử trùng 1atm/
30 phút.
*MT3 - MT Malt Extract Agar (MEA): Dùng để bảo quản NS [22], [54]
Pepton 1g; Malt Extract 20g; glucose 20g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 5 – 6; khử trùng 1amt/30 phút.
*MT4 - MT cảm ứng tổng hợp amylase: Dùng để phân lập nhanh các chủng NS sinh amylase[11], [13], [21]
NaNO3 3.5g; K2HPO4 1.5g; MgSO4.7H2O 0.5g; KCl 0.5g; FeSO4.7H2O 0.1g (vết); tinh bột tan
10g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 6.5; khử trùng 1atm/ 30 phút
*MT5 - MT cảm ứng tổng hợp cellulose [1]: Tương tự MT4 nhưng thay 10g tinh bột tan bằng 10g CMC.
*MT6 - MT cảm ứng tổng hợp protease [26]: Tương tự MT4 nhưng khơng sử dụng NaNO3
và thay 10g tinh bột tan bằng 10g casein.
*MT7 - MT cảm ứng tổng hợp chitinase[26]: Tương tự MT4 nhưng thay 10g
tinh bột tan bằng 10g chitin.
*MT8 - MT cảm ứng tổng hợp pectinase[26]:
200g cà rốt gọt vỏ, xay nhỏ, đun với 1000ml nước biển trong 60 phút, thêm 1 ít CaCO3 để trung hịa MT. Sau đĩ lọc lấy nước trong, bổ sung 20g agar; pH = 6,5; khử trùng 1atm/30 phút.
Pepton 5g; NaCl 5g; cao thịt 5g; agar 20g; nước cất 1000ml; pH = 7.5; khử trùng 1atm/ 30
phút.
*MT10 – MT thử khả năng phân giải dầu [1],[11], [35]:
KH2PO4 0,3g; MgSO4 0,4g; KNO3 3g; Na2HPO4 0,7g; Dầu DO 50ml; nước biển 950ml; khử trùng 1atm/ 30 phút
Một số MT bán rắn khảo sát khả năng sinh amylase
*MT11 [1], [11], [26]: Cám mì 65g; trấu 25g; bột bắp 7,5g; NaNO3 2g; MgSO4 0,05g; KH2PO4 0,2g; KCl 0,05g; urê 0,2g; độ ẩm 50 - 60%, pH = 5 – 6, khử trùng 1atm/ 30 phút.
*MT12 [21], [26]: Trấu 55g; cám 30g; bột bắp 5g; bã khoai mì 5g; đường 4g; (NH4)2HPO4 0,1g; ure 0,2g; CaCl20,1g; KCl 0,05g; HCl 0,05g; độ ẩm 50 – 60%; khử trùng 1atm/45 phút.
*MT13 [21], [26]: 90% bã khoai mì; 10% trấu, bổ sung dung dịch khống (KH2PO4 0,1%; NH4Cl 0,1%; KNO3 0,3%; MgSO4 0,05%) cho đủ độ ẩm 60%; khử trùng 1atm/30 phút.
*MT14 [15]: 50% cám gạo; 33% bã khoai mì; 17% trấu; độ ẩm 60%; pH 5-5,5; khử trùng
1atm/30 phút.
*MT15 [15]: Cám 60%; bột đậu nành 30%; bột ngơ 10%; trấu 25%; độ ẩm 60%; pH 5,0-5,5;
khử trùng 1atm/60 phút.
2.2. Hĩa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Hĩa chất
- Cồn, NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, KCl, FeSO4.7H2O, NaCl, HCl,... - Glucose, cao nấm men, nước chiết khoai tây, tinh bột tan, agar, peptone, cao thịt, casein, thuốc thử lugol, HgCl2, Dinitrosalysilic, lactophenol…
- Chất KS: Cloramphenycol (Ấn Độ)
2.2.2. Dụng cụ
Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, pipet, que cấy, que gạt, bơng mỡ, đèn cồn, cốc thủy tinh,
2.2.3. Thiết bị
Tủ cấy vơ trùng (Việt Nam), tủ lạnh (National - Nhật), tủ giữ mẫu (Sanyo - Nhật), máy giập mẫu (Đức), máy lắc Gerhardt (Đức), cân điện Sartorius (Đức), tủ sấy Memmert (Đức), nồi hấp áp lực Autoclave (Đài Loan), máy đo quang phổ UV – Visible spectrophometer (Nhật), máy chụp hình kỹ thuật số Olympus 5.1 (Nhật), máy đo pH (Pometer KL-009 (II) (Trung Quốc), máy ly tâm Rotina (Đức), cân phân tích điện tử Scientech (Mỹ), máy đo độ ẩm Startorius (Đức),...
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Tiến hành lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Cần Giờ: Xã Bình Khánh, xã Tam Thơn Hiệp, xã An Thới Đơng, xã Long Hịa…Đi sâu vào các rừng già, cách biển khoảng 2km, các điểm lấy mẫu cách nhau khoảng 200m. Vị trí lấy mẫu theo những vị trí chấm đỏ trên bản đồ. Khu vực lấy mẫu là vùng nước lợ cĩ độ mặn 3%, nhiệt độ khoảng 290C; pH 7,02
Lấy các mẫu đất mặt, đất sâu 5-10 cm, lá vàng sắp rụng, lá rụng bị mục, thần cành chết khơ cịn trên cây, thân cành chết đang bị phân hủy trên mặt đất.
Cách lấy: Dùng dao, kéo vơ trùng cắt khoảng 20g mẫu cho vào túi ni lơng vơ trùng buộc kín,
đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, ngày tháng, bảo quản trong thùng nước đá vận chuyển về PTN và giữ ở tủ giống 40C. Các mẫu được phân lập ngay khơng giữ quá 24 giờ [43].
2.3.2. Phương pháp vi sinh
2.3.2.1. Phân lập mẫu theo phương pháp pha lỗng mẫu (F. Uyenco, 1988) * Lấy mẫu và pha lỗng
Lấy 10g mẫu lá, đất, thân, cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển Cần Giờ vơ trùng. Sau đĩ dập mẫu bằng máy nghiền mẫu trong vịng 2 phút, tốc độ 230 vịng/ phút. Túi lọc mẫu giữ lại chất hữu cơ, phần dịch hơi đục chảy ra bên ngồi. Lấy dịch lọc ta được dung dịch pha lỗng 10-1.
Lắc đều, hút 1ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vơ trùng ta được dung dịch pha lỗng nồng độ 10-2.
Tiếp tục pha lỗng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4…
* Cấy mẫu
Nhỏ 2 giọt dung dịch ở mỗi nơng độ lên đĩa petri chứa MT czapek- dox cải tiến. Dùng que trang trải đều khắp mặt thạch. Sau đĩ sử dụng que trang đĩ trang tiếp hai đĩa tiếp theo.
http://www.saigonesl.com/City_Maps_Collection/pages/County_Can_Gio_gif.htm
Hình 2.1. Bản đồ tổng quan về RNM Cần Giờ và các vị trí lấy mẫu * Ủ mẫu
Lật ngược đĩa petri, gĩi vào giấy báo, ủ ở nhiệt độ phịng từ 3-7 ngày. Chọn khuẩn lạc riêng rẽ cấy chuyền vào ống thạch nghiêng.
* Làm thuần
Lấy một khuẩn lạc riêng rẽ trong ống thạch nghiêng, hịa vào nước cất, trải
đều trên mặt đĩa lần 2. Nếu các dạng khuẩn lạc đồng đều, cĩ màu sắc giống nhau, soi dưới kính hiển vi đều cĩ 1 dạng tế bào chứng tỏ giống phân lập thuần khiết.
Sau đĩ chọn khuẩn lạc riêng rẽ cấy truyền vào 3 ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hĩa.
2.3.2.2. Giữ giống trên MT thạch dưới lớp dầu khống (Lumiere và Chevrotier – 1914)
Chuẩn bị ống giống đã nuơi ở nhiệt độ phịng và thời gian thích hợp. Dầu khống chứa trong ống eppendorf hấp vơ trùng ở 1210C trong 2 giờ rồi sấy khơ ở 1700C trong 1-2 giờ, để nguội. Dùng que cấy lấy bào tử NS cho vào eppendorf chứa dầu khống vơ trùng. Hàn kín eppendorf bằng paraffin, bảo quản ở nhiệt độ 40C.
Phương pháp này cĩ thể bảo quản trong 1-3 năm.
2.3.2.3. Quan sát đại thể NS [6], [7]
NS sau khi cấy truyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo KL khổng lồ như sau - Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vơ trùng.
- Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm. Lắc đều tạo dung dịch huyền phù.
- Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chĩng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri. Làm 2-3 hộp.
- Ủ ấm trong một tuần để tạo KL. Hàng ngày lấy ra quan sát - Dùng kính lúp ba chiều soi mơ tả các đặc điểm:
+ Hình thái, kích thước KL
+ Màu sắc mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc của KL + Màu sắc của MT do sắc tố NS tạo ra.
+ Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT, đặc điểm của mép KL + Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt Kl……
2.3.2.4. Quan sát vi thể NS - Phương pháp cấy khối thạch [8]
- Chuẩn bị MT thích hợp, đổ một lớp mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri. - Dùng khoan nút chai vơ trùng cĩ d = 8mm, khoan các khối thạch.
- Chuẩn bị đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bơng thấm nước, nước cất vơ trùng.
- Đặt 1 hoặc 2 khối thạch trên mỗi phiến kính. Cấy một ít bào tử lên bề mặt xung quanh khối thạch. Đặt lá kính vơ trùng lên trên bề mặt các khối thạch.
- Các phiến kính cĩ khối thạch cấy NS nghiên cứu được đặt trong các hộp petri cĩ sẵn một ít bơng thấm nước được làm ẩm bằng nước cất vơ trùng. Các hộp petri này được bao và giữ trong tủ ấm 3 - 4 ngày.
- Khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch cĩ một giọt dung dịch lactophenol, ta được tiêu bản thứ nhất.
- Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần NS trên phiến kính, nhỏ giọt lactyophenol, đậy lá kính lên trên ta được tiêu bản thứ hai.
- Dùng kính hiển vi quan sát và vẽ mơ tả các đặc điểm + Hình dạng cuống sinh bào tử.
+ Hình dạng thể bình.
+ Sợi nấm cĩ hay khơng cĩ sự phân nhánh và vách ngăn. + Đặc điểm bào từ đính, màu sắc, kích thước bào tử… 2.3.2.5. Định danh NS bằng kĩ thuật di truyền phân tử (PCR).[40]
Nguyên tắc:
Dùng phương pháp PCR để khuếch đại một trình tự gen lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên biệt là NK28s-F và NK28s-R đặc hiệu một đoạn ADN dài 260 bps cĩ chứa các trình tự đặc hiệu giống. Các phân đoạn ADN sẽ được phân tách qua điện di trên gel agarose 2%. Giải trình tự sản phẩm này và đối chiếu với ngân hàng dữ liệu gen NCBI để định danh NS [40].
Các bước tiến hành:
- Nuơi cấy chủng NS trong ống nghiệm từ 2-3 ngày rồi lấy một lượng mẫu NS khoảng ½ hạt gạo
cho vào một tube eppendorf
- Cho thêm 180µl TE1X và 20µl Prokprep rồi đem ủ ở 560C qua đêm
- Thêm 500µl Phenol Buffer và 500µl L2 vào vortex khoảng 15 giây rồi đun sơi ở 1000C trong 15 phút.
- Sấy nhẹ rồi thêm vào 250µl Chloroform/Isoamyl Alcohol vào vortex, lắc đều rồi ly tâm 14,000 vịng/phút trong 10 phút
- Hút 450µl dịch nổi sang một tube eppendorf mới. Sau đĩ thêm vào 500µl Isopropanol. Giữ tube ở nhiệt độ -200C trong 1 – 2 giờ
- Ly tâm 14,000 vịng/phút trong 15 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch nổi
- Ly tâm 14,000 vịng/phút trong 15 phút. Đổ bỏ dịch nổi - Làm khơ cặn DNA ở 560C trong 10 – 15 phút
- Hịa tan cặn DNA trong 50µl TE1X. Lấy 5µl dịch ly trích DNA này để thực hiện kỹ thuật PCR nấm
- Lấy 5µl DNA của NS sau khi ly trích của vào PCR mix.
-Tiến hành điện di nhúng chìm trên gel agarose 2% điện di trên DNA chip trên hệ thống Bio Analyzer. Sản phẩm PCR cĩ độ dài 260 bps.
- Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch thì tiến hành giải trình tự gen 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH để xác định chi và lồi của chủng nghiên cứu [40]
2.3.2.6. Xác định hoạt tính enzym ngoại bào: bằng khuyếch tán trên MT thạch (William, 1983).
Nguyên tắc:
Dùng thuốc thử với cơ chất màu đặc trưng, phần cơ chất bị NS phân hủy sẽ khơng tạo màu mà tạo vịng phân giải trong suốt quanh khuẩn lạc
Cách tiến hành:
Dùng MT định tính đo khả năng phân giải các hệ enzym.
+ Phương pháp cấy chấm điểm: Chuẩn bị các chủng NS nghiên cứu và MT thử hoạt tính
enzyme tương ứng (MT4, MT5, MT6, MT7, MT8) cấy chấm điểm (3 điểm/đĩa), giữ các đĩa trong 28-30oC, 3-4 ngày.
+Phương pháp đục lỗ trên thạch:
- Thu dịch nuơi cấy NS: dùng que cấy vơ trùng lấy 1 vịng que cấy NS vào bình tam giác chứa 50ml MT lỏng vơ trùng. Nuơi cấy trên máy lắc (160 vịng/phút), 4 ngày, 25-28oC
- Ly tâm dịch nuơi cấy 3000 tốc độ vịng/phút trong 20 phút.
- Lọai bỏ sinh khối, phần dịch ly tâm cho vào các bình vơ trùng là dịch enzym thơ, bổ sung 0,04% NaNO3 để khử trùng; cĩ thể giữ dịch ly tâm 1 tháng trong tủ lạnh sâu ở -20oC.
- Dùng khoan nút chai vơ trùng (d = 8mm) khoan các lỗ thạch trên MT nghiên cứu tương ứng trong các đĩa.
- Dùng pipet vơ trùng nhỏ 0,1ml dịch enzym thơ vào các lỗ khoan trên các MT thử hoạt tính tương ứng. Giữ các hộp petri ở tủ lạnh 40C trong 4 - 6 giờ. Sau đĩ chuyển sang tủ ấm 28-300C trong 24giờ.
- Thuốc thử lugol (hỗn hợp 0,05% I2 với 2,65%KI) cho amylase, cellulose, kitinase; dung dịch 10% HgCl2 cho protease, nhỏ lên bề mặt thạch và đo đường kính vịng phân giải bằng thước đo KL.
Kiểm tra kết quả
- Kiểm tra hoạt tính amylase, cellulase, kitinase:
+ Nếu NS cĩ hoạt tính amylase sẽ tạo vịng trong suốt quanh Kl hoặc lỗ khoan chứa
dịch enzym. Vùng tinh bột chưa bị phân giải cĩ màu xanh tím đậm.
+ Nếu NS cĩ hoạt tính cellulase sẽ tạo vịng trong suốt quanh Kl hoặc lỗ khoan chứa
dịch enzym. Vùng cellulose chưa bị phân giải cĩ màu tím hồng nhạt.
+ Nếu NS cĩ hoạt tính kitinase sẽ tạo vịng trong suốt quanh Kl hoặc lỗ khoan chứa
dịch enzym. Vùng kitin chưa bị phân giải cĩ màu nâu đỏ nhạt.
- Kiểm tra hoạt tính protease: Dùng HgCl2 nhỏ lên bề mặt thạch. Nếu NS cĩ hoạt tính protease sẽ tạo vịng trong suốt quanh Kl hoặc lỗ khoan chứa dịch enzym. Vùng chứa protein chưa
bị phân giải cĩ màu trắng đục do khi phản ứng với HgCl2 protein bị kết tủa.
Đánh giá kết quả
- Đặt sấp hộp petri. Dùng thước đo đường kính vịng phân giải (D) và đường kính KL (d), hoặc đường kính lỗ thạch (d = 8mm)
- Dựa vào kết quả (D-d, mm) để đánh giá hoạt tính enzym của các chủng NS
Quy ước: D-d ≥ 25 mm: hoạt tính enzym mạnh; D-d ≥ 20 mm: hoạt tính enzym khá mạnh; D-d ≥
15 mm: hoạt tính enzym trung bình; D-d ≤ 10 mm: hoạt tính enzym yếu.
2.3.2.7. Xác định hoạt tính KS (Egorov và cộng sự, 1969)
Nguyên tắc:
Chất KS do NS sinh ra sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định làm cho VSV khơng phát triển được xung quanh lỗ khoan chứa dịch KS hay khối thạch chứa nấm tạo vịng vơ khuẩn trong suốt.
Cách tiến hành (Phương pháp khối thạch) :
+ Cấy các chủng NS nghiên cứu vào MT2 (thay nước biển bằng nước cất) ủ trong tủ ấm từ 3 – 4 ngày.
+ Lấy một vịng que cấy VSV kiểm định cho vào 3ml nước cất lắc đều tạo dung dịch huyền phù.
+ MT9 sau khi hấp khử trùng để nguội 40oC, cho dung dịch huyền phù chứa VSV kiểm định vào lắc đều và đổ một lớp mỏng lên đĩa petri, để nguội.
+ Dùng khoan nút chai vơ trùng khoan các khối thạch cĩ NS cần thử hoạt tính KS. Đặt các khối thạch vào đĩa petri cĩ MT9 đã cấy VSV kiểm định
-Khả năng sinh KS được đánh giá bằng hiệu số (D - d, mm). Trong đĩ D: đường kính vịng phân
giải, d: đường kính KL (lỗ thạch)
- Quy ước: D-d ≥ 25 mm: hoạt tính KS rất mạnh; D-d ≥ 20 mm: hoạt tính KS mạnh; D-d ≥ 15
mm : hoạt tính KS trung bình; D-d ≤ 10 mm: hoạt tính KS yếu
2.3.2.8. Khảo sát khả năng phân giải dầu
Cách tiến hành:
Cấy NS trong bình tam giác 250ml chứa 50ml dầu khống (MT10). Sau 15 ngày nuơi cấy tĩnh ở nhiệt độ phịng, đo sinh khối của NS, kiểm tra sự phân bố các giọt dầu và mùi để đánh giá khả năng phân giải dầu của NS [35]
Cách đo sinh khối NS:
- Cấy bào tử NS vào bình tam giác.
- Sau 15 ngày nuơi cấy, lọc lấy sinh khối NS và đem sấy khơ ở 1050C
- Cân trọng lượng của tờ giấy thấm, sau đĩ cân sinh khối NS trên tờ giấy. Lấy kết quả sau trừ kết quả trước ta thu được kết quả sinh khối NS [32].
2.3.2.9. Phương pháp nuơi cấy NS trên MT lên men bán rắn (MT11)
Mục đích: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp amylase của các chủng NS nghiên cứu
Cách tiến hành:
- Cho vào mỗi bình tam giác (250ml) 15g MT xốp, hấp khử trùng 1atm/ 30 phút.
- Cho 10ml nước cất vơ trùng vào mỗi ống nghiệm nuơi NS. Dùng que cấy cà nhẹ lên bề mặt thạch để lấy hết bào tử, lắc đều cho bào tử ở dạng huyền phù.
- Lấy 3ml dịch bào tử (khoảng 105 – 106 bào tử/1g MT) cho vào MT xốp đã chuẩn bị. Nuơi