2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu sinh học
2.1.1.1 Mẫu HBV DNA dùng làm mẫu chứng
* Mẫu chứng dương (Amplicon)
Xây dựng amplicon làm mẫu chứng dương mang các đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng ADV trên vùng RT của HBV polymerase, được tổng hợp bởi IDT (Hoa Kỳ).
* Mẫu HBV hoang dại
Là mẫu không chứa các đột biến kháng ADV tại các vị trí rt181 và rt236 được xác định bằng phương pháp giải trình tự.
2.1.1.2 Mồi và mẫu dò
Trình tự và vị trí các oligonucleotide thiết kế và tổng hợp bởi IDT (Hoa Kỳ). Bảng 2.1: Trình tự và vị trí các mồi và probe sử dụng trong đề tài
Tên Trình tự 5’→3’ Vị trí nt F181 TATTCCCATCCCATCATCYTGGGCT 601 - 625 R181-1 CACTGAAATGGCACTAGTAAACTGAA* 699 - 671 R181-2 CACTGAAATGGCACTAGTAAACTGAGT** 699 - 670 P181 FAM-AGAAACGGACTGAGGCCCACTCCCA-TAMRA 641 – 665 F236 TGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGT 724 - 751 R236 CCCCAWCKTTTKGTTTTRTKAGGGG*** 680 - 836 P236 FAM-TGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGT-TAMRA 754 - 783
Ghi chú: * Vị trí bắt cặp nucleotide dạng đột biến tại codon rt181 nằm trên đầu 3’ của mồi
ngược R181-1. ** Vị trí bắt cặp nucleotide dạng đột biến tại codon rt181 nằm trên đầu 3’ của mồi ngược R181-2. *** Vị trí bắt cặp nucleotide dạng đột biến tại codon rt181 nằm trên đầu 3’ của mồi ngược R236.
Bao gồm các mẫu bệnh phẩm dương tính với HBV được thu nhận từ các phòng khám và xét nghiệm y khoa thuộc các tỉnh miền Trung trở vào và các phòng khám dịch vụ ở thành phố Hồ Chí Minh.
2.1.2 Dụng cụ và thiết bị
Bao gồm dụng cụ và thiết bị của một phòng xét nghiệm vi sinh cơ bản: - Pipetman 1000μl, 200μl, 100μl, 10μl và các đầu tip tương ứng;
- Eppendorf 0,2ml và eppendorf 1,5ml;
- Máy ly tâm siêu tốc và máy ly tâm lạnh (tốc độ 13000 vòng/phút); - Máy luân nhiệt (máy real-time PCR);
- Máy vortex, máy ủ nhiệt khô, tủ lạnh, tủ kính vô trùng; - Máy tính có phần mềm kết nối với máy real-time PCR. 2.1.3 Hóa chất sử dụng
2.1.3.1 Hóa chất tách chiết HBV DNA (MERCK)
Hóa chất sử dụng tách chiết HBV DNA bằng phương pháp tủa (Chomczynski & Sacchi, 1987) bao gồm:
- Dung dịch 1: Dung dịch Trizol, gồm có: + Phenol 38%;
+ Guanidium thyocianate 0,8%; + Glycerol 5%;
+ Điều chỉnh pH = 8. - Dung dịch 2: Cloroform.
- Dung dịch 3: Isopropanol tuyệt đối có bổ sung chất trợ tủa. - Dung dịch 4: Ethanol 70%.
- Dung dịch 5: Dung dịch TE 1X (Tris 0,1M – EDTA 0,001M). 2.1.3.2 Hóa chất sử dụng trong phản ứng real-time PCR (QIAGEN)
- Đệm TE 1X: 10 mM Tris – HCl (pH 8,0), 1mM EDTA vô trùng; - Nucleotide các loại: dATP, dGTP, dCTP, dTTP;
- Taq DNA polymerase; - Dung dịch MgCl2. 2.2 Nội dung nghiên cứu
- Thiết kế các cặp primer và TaqMan probe đặc hiệu với các vị trí đột biến kháng ADV của HBV
bằng phần mềm chuyên dụng và các công cụ trên NCBI và IDT.
- Tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng real-time PCR, tiến hành khảo sát các thông số sau: khả năng nhân bản của hệ primer-probe, nhiệt độ lai, nồng độ primer và probe, nồng độ Mg2+, độ nhạy của phản ứng, độ đặc hiệu của hệ primer và probe.
- Thiết lập quy trình phản ứng phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng ADV của HBV bằng kỹ thuật real-time PCR.
- Tiến hành chạy trên một số mẫu bệnh phẩm. 2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp thiết kế và kiểm tra các oligonucleotide (mồi và mẫu dò) bằng cơ sở dữ liệu trên IDT và các phần mềm sinh học chuyên dụng như ClustalX và Annhyb
2.3.1.1 Các bước tiến hành
Vì đột biến kháng ADV nằm trên vùng RT của gen HBV polymerase, do vậy, chúng tôi thu thập tất cả các trình tự về vùng gen HBV Polymerase đã được xác định cho đến nay từ ngân hàng dữ liệu gen NCBI (National Center for Biology Information).
Sau đó, chúng tôi tiến hành so hàng (alignment) trên tất cả các trình tự tải về bằng phần mềm ClustalX. Dựa trên sự so hàng và kết quả công bố của các bài báo trước đó, chúng tôi chọn các vùng gen để thiết kế các cặp mồi (primer) và mẫu dò (probe) tương ứng với các đột biến kháng ADV tại hai vị trí là rt181 và rt236.
Đặc tính của các oligonucleotide thiết kế được kiểm tra và chỉnh sửa để phù hợp với tiêu chuẩn (%GC, Tm…) bằng phần mềm trực tuyến OligoAnalyzer (IDT) và Annhyb.
Sau khi đã thiết kế được các cặp mồi và mẫu dò có các thông số phù hợp, tôi tiến hành Blast search với các trình tự DNA có trên Ngân hàng dữ liệu gen của NCBI để xác định các trình tự mồi và mẫu đã thiết kế là đặc hiệu cao với DNA đích của HBV.
2.3.1.2 Các nguyên tắc thiết kế các oligonucleotide
* Nguyên tắc thiết kế mồi [10,17,21]
- Chúng tôi thiết kế các mồi ngược bắt cặp đặc hiệu với các vị trí đột biến, mồi xuôi bắt cặp hoàn toàn với cả bản mẫu hoang dại và đột biến.
- Mồi thường dài từ 15-30 nucleotide. Hàm lượng GC cho phép khoảng 20-80% (tốt nhất là 50- 60%). Nucleotide G và C phải được phân bố đều khắp trình tự thiết kế. Thiết kế mồi sao cho base G và C nằm ở hai đầu của mồi. Tránh trường hợp đầu 3’ của mồi có nhiều hơn 3 nucleotide G hoặc C, vì mồi không đặc hiệu có thể được tạo ra.
- Nhiệt độ nóng chảy của các mồi xuôi và ngược chênh nhau không quá 50C, và kiểm soát nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi nằm trong khoảng 50-650C.
- Mồi không được tự bắt cặp bổ sung hoặc bắt cặp bổ sung với mồi khác trong hỗn hợp phản ứng tạo thành các cấu trúc thứ cấp như:
Self-dimer: Cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các base của các mồi giống nhau.
Hairpin loop (Cấu trúc kẹp tóc): Cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các base trong cùng một mồi, đặc biệt nên tránh cấu trúc kẹp tóc chìm sâu ở đầu 3’ của mồi. Hetero-dimer: Cấu trúc được hình thành do sự bắt cặp bổ sung giữa các base của
oligonucleotide khác nhau.
- Năng lượng tự do (∆G) giữa các cấu trúc thứ cấp không vượt quá -9kcal.mol-1.
* Nguyên tắc thiết kế mẫu dò [17,21]
Nguyên tắc thiết kế mẫu dò cũng tương tự như nguyên tắc thiết kế mồi:
- Mẫu dò bắt cặp đặc hiệu với cả bản mẫu hoang dại và đột biến, nằm giữa hai mồi xuôi và ngược. - Thành phần GC trong trình tự nucleotide của mẫu dò phải nằm trong khoảng 30-80%.
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mẫu dò phải lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của các mồi từ 5-100C nhằm đảm bảo cho việc bắt cặp hoàn toàn với sợi DNA khuôn trong bước bắt cặp và kéo dài của chu kỳ PCR.
- Không nên có G ở đầu 5’ của mẫu dò vì G có thể hấp thu ánh sáng huỳnh quang ngay cả khi
mẫu DNA bị phân giải bởi Taq polymerase.
2.3.1.3 Các phần mềm máy tính sử dụng - ClustalX 1,83;
- Annhyb 4,930 (Olivier Friard, Hoa Kỳ);
- Phần mềm trực tuyến BLAST (NCBI, Hoa Kỳ);
- Phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3,0 (IDT, Hoa Kỳ);
2.3.2 Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu từ bệnh nhân cho vào ống nghiệm thu máu chuyên dụng. - Ly tâm ống nghiệm chứa máu 3000 vòng/phút trong 15 phút.
- Thu khoảng 0,5ml huyết thanh chuyển vào 1 eppendorf 1,5ml sạch. - Giữ eppendorf huyết thanh ở -200C cho đến khi tiến hành xét nghiệm.
2.3.3 Phương pháp tách chiết HBV DNA
Để tách chiết HBV DNA, chúng tôi sử dụng phương pháp tủa (Chomczynski & Sacchi, 1987). 2.3.3.1 Nguyên tắc
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dùng các tác nhân biến tính mạnh để phá vỡ vỏ bao của virus và loại bỏ các thành phần không mong muốn (protein…). Để thu nhận DNA tinh sạch, ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. DNA sẽ được tủa bởi isopropanol ở điều kiện lạnh và thu lại qua các lần ly tâm. Sau đó, cặn DNA được huyền phù trong TE 1X và bảo quản ở -20oC.
2.3.3.2 Cách tiến hành
- Đánh dấu các tube vô trùng bằng ký hiệu mẫu.
- Cho 200μl mẫu (huyết thanh) vào 1 tube vô trùng có sẵn 900μl dung dịch 1, vortex 30 giây, để yên 10 phút. Thêm vào 200μl dung dịch 2, trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Thu 600μl dịch nổi có chứa DNA (chú ý chỉ thu dịch nổi) vào 1 tube vô trùng khác có sẵn 600μl dung dịch 3 (trộn đều trước khi sử dụng). Sau đó, trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh (tránh loại bỏ phần cặn). Cho từ từ 900μl dung dịch 4 vào. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
- Loại bỏ hết dịch nổi (dùng pipet 200μl hút sạch phần dịch nổi), thu cặn (tránh loại bỏ luôn phần cặn). Để khô ở 600C trong 10-15 phút. Cho vào 50μl dung dịch 5.
- Bảo quản mẫu DNA ở -200C.
2.3.4 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction – Phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Thực chất đây là một phương pháp tạo
dòng in vitro (không cần sự hiện diện của tế bào) tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích
DNA ban đầu, nhờ hoạt động của DNA polymerase và một cặp mồi đặc hiệu.
Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới có trình tự bổ sung ngược chiều với mạch khuôn. Nếu có hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung ở hai đầu của một trình tự DNA, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase trong phản ứng PCR, số lượng bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được nhân lên (khuếch đại) đến mức có thể thấy được vạch DNA sau khi nhuộm bằng ethidium bromide. Vậy để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo cặp mồi chuyên biệt. Cặp mồi này gồm một mồi xuôi (sense primer) và một mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gen [5].
Phản ứng PCR nhân bản sao DNA là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
Hình 2.1: Nguyên tắc của phương pháp PCR
Giai đoạn biến tính (Denaturation): ở nhiệt độ cao 90 – 950C (cao hơn Tm của DNA khuôn) trong vòng 30 giây đến 1 phút. Mục đích: Làm đứt các liên kiết hydro của phân tử DNA. DNA tách mạch, từ mạch đôi thành mạch đơn.
Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Nhiệt độ khoảng 45 – 700C (thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn). Giai đoạn này khoảng 30 giây đến 1 phút.
Giai đoạn tổng hợp (Elongation): Nhiệt độ 70 – 720C thích hợp cho điều kiện hoạt động của enzyme DNA polymerase chịu nhiệt. Mạch mới được hình thành từ mồi được nối dài theo chiều 5’- 3’, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân [5,11,12,13,15].
2.3.5 Phương pháp real-time PCR
Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc, bằng cách điện di trên gel agarose. Ngược lại, real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra, đó là ý nghĩa của cụm từ “real-time”. Real- time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: khuếch đại DNA bằng PCR và đo độ phát quang tỷ lệ thuận với số lượng phân đoạn DNA tạo thành [17]. Khả năng này được thực hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang. Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là probe.
Hệ thống real-time PCR bao gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy phát hiện quang phổ huỳnh quang và máy vi tính. Nguyên lý chủ yếu của real-time PCR là dựa trên cơ sở phát hiện và định lượng thể thông báo huỳnh quang [17].
Ưu điểm chính của real-time PCR so với PCR truyền thống là nó cho phép xác định số lượng bản sao khuôn mẫu ban đầu với sự chính xác và độ nhạy cao trong một phạm vi biến thiên rộng. Kết quả real-time PCR có thể là kết quả định tính (hiện diện hay vắng mặt một trình tự DNA) hay định lượng (số lượng bản sao DNA). Real-time PCR sử dụng để định lượng được gọi là PCR định lượng. Ngược lại, PCR truyền thống chỉ được xem là bán định lượng. Thêm vào đó, dữ liệu real-time PCR có thể được đánh giá mà không cần phải điện di trên gel, giúp tiết kiệm thời gian và gia tăng số lượng thí nghiệm thực hiện. Đồng thời, việc tiến hành phản ứng và đánh giá dữ liệu trong một hệ thống đóng kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm và loại bỏ những thao tác sau phản ứng khuếch đại.
Hình 2.2: Nguyên tắc real-time PCR sử dụng TaqMan probe
2.3.6 Phương pháp tối ưu hóa phản ứng real-time PCR [17,21]
Phản ứng real-time PCR thường chịu nhiều ảnh hưởng của các thành phần và điều kiện phản ứng. Trong phần thực nghiệm này, chúng tôi kiểm chứng một số điều kiện tối ưu trong phản ứng real-time PCR như: khả năng nhân bản của hệ primer-probe, nhiệt độ lai của phản ứng, nồng độ mồi, mẫu dò và nồng độ ion Mg2+, độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng.
Sau một số chu kỳ nhất định, các thành phần trong phản ứng bị phân hủy hay bị cạn kiệt, các sản phẩm phụ hình thành gây ức chế phản ứng và các bản sao vừa được tổng hợp không bắt cặp với mồi mà tự bắt cặp với nhau, làm cho hiệu quả khuếch đại giảm. Vì vậy, để thu được kết quả cao cần thực hiện phản ứng không quá 40 chu kỳ. Để đảm bảo tính ổn định về nhiệt độ giữa các lần khảo sát nên sử dụng cùng một loại thiết bị và dụng cụ. Đồng thời, để tránh các trường hợp ngoại nhiễm, cần sử dụng tất cả dụng cụ mới cho phản ứng.
2.3.6.1 Khảo sát khả năng nhân bản của hệ mồi, mẫu dò
Trong phương pháp real-time PCR, mồi và mẫu dò và yếu tố quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Khả năng bắt cặp của mồi, mẫu dò với DNA bản mẫu là hết sức quan trọng. Nó quyết định sự thành công hay thất bại của toàn bộ quy trình từ khâu thiết kế cho đến các kết quả trong thực nghiệm. Nếu mồi và mẫu dò hoạt động tốt thì khi khảo sát sẽ cho kết quả dương tính với mẫu chứa amplicon
1 - Biến tính
3 - Kéo dài 2 - Bắt cặp
đột biến và cho kết quả âm tính với mẫu chứa codon hoang dại. Nếu mồi và mẫu dò không hoạt động tốt hoặc không cho ra kết quả thì không đạt yêu cầu và phải thiết kế lại [17].
Tiến hành khảo sát khả năng nhân bản của hệ primer và probe trên hai chủng đối chứng với đầy đủ các thành phần của một phản ứng real-time ở thể tích 25μl.
2.3.6.2 Khảo sát nhiệt độ lai của phản ứng
Nhiệt độ lai (nhiệt độ bắt cặp) của phản ứng phụ thuộc trực tiếp vào độ dài và thành phần của các oligonucleotide. Nên sử dụng nhiệt độ bắt cặp Ta (annealing temperature) thấp hơn 50C so với nhiệt độ nóng chảy Tm của cặp mồi sử dụng. Nếu tạo ra sản phẩm không đặc hiệu, nhiệt độ bắt cặp phải được tối ưu bằng cách tăng từng bước từ 1-20C. Khi nhiệt độ bắt cặp Ta quá thấp, các mồi có thể bắt cặp với các trình tự đích khác do những base đơn bắt cặp nhầm có thể xảy ra. Điều này rất tốt với mục đích khuếch đại các trình tự tương tự hay họ hàng. Tuy nhiên, nó có thể dẫn tới khuếch đại không đặc hiệu và giảm hiệu suất sản phẩm mong muốn nếu base đầu 3’ của mồi bắt cặp với trình tự đích. Nếu giá trị Ta quá