2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu
Nguyên liệu để nghiên cứu gồm toàn bộ phần trên mặt đất của cây chó đẻ răng cưa, thu hái vào tháng 11 năm 2007 tại vùng giáp ranh giữa Huyện Đồng Hỷ và Thành Phố Thái Nguyên.
Cây chó đẻ răng cưa còn gọi là cây diệp hạ châu, dân địa phương gọi là diệp hòe thái, các nhà khoa học ở khoa Sinh trường ĐHSP Thái Nguyên xác định tên khoa học là “Phyllanthus urinaria L.”. Họ thầu dầu (Euphorbiaceae).
Mẫu cây tươi sau khi thu hái gồm cả thân, lá và quả được đem sấy ở 800C trong 10 phút để diệt men, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 600C cho tới khi khô hoàn toàn. Mẫu khô được nghiền nhỏ và ngâm chiết trong etanol 90o
ở nhiệt độ phòng nhiều lần, liên tục trong 10 ngày.
Sau khi cất loại dung môi, cặn cô đến dưới dạng xirô được chiết lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etylaxetat, n- butanol, metanol. Các dịch chiết được đuổi kiệt dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 500
C dưới áp suất thấp. Các cặn thô được phân chia bằng sắc kí cột với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân lập các chất có độ phân cực gần giống nhau, kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong hệ dung môi thích hợp để thu được các chất sạch .
2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết
Để phát hiện, phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây chó đẻ răng cưa chúng tôi đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí và kết tinh lại trong dung môi thích hợp các phương pháp gồm:
24
- Sắc kí lớp mỏng (SKLM).
- Sắc kí cột silicagen, thường dùng silicagen Merck 63- 200nm. - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại.
2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
Các chất kết tinh phân lập ra được xác định những hằng số vật lý đặc trưng: màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nóng chảy, ghi các loại phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1
H- NMR, phổ 13C- NMR, phổ khối lượng (MS) và các phổ phân giải cao. Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hoá học của chúng.
2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu
2.2.1. Dụng cụ và hoá chất
Các loại dung môi dùng để ngâm chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn các loại dung môi dùng để sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng, dùng để kết tinh lại là hoá chất loại tinh khiết phân tích (PA).
Sắc kí lớp mỏng dùng bản mỏng đế nhôm DC – Alufolien Kiesegel 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dich chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được.
Các hệ dung môi khai triển SKLM:
1. n-Hexan – CHCl3 85:15 Hệ A
2. Cloroform – etylaxetat 90:10 Hệ B
3. Cloroform – metanol 90:10 Hệ C
4. Cloroform – metanol 50:10 Hệ D
25
Các bản SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV- BIOBLOCK ) ở bước sóng = 254nm và 365nm. Thuốc thử để hiện màu là vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 5%, sau đó sấy trên 1000
C . Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai có biểu thức:
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu
- Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boetus (Đức), hoặc trên máy Eletronthermal IA–9200.
- Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 dạng viên nén KBr. - Phổ LC/MS ghi trên máy ESI-LC/MS 1100 MSD Trap spectrometer. - Phổ khối ghi trên máy MS-Engine-5989-HP ion hoá bằng va chạm eletron (EI- MS) 70ev và sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L.
- Phổ 1H-NMR và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz, nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3, DMSO, aceton-D6.
2.3. Các dịch chiết từ cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L)
2.3.1. Các dịch chiết
Toàn bộ phần trên mặt đất của cây chó đẻ răng cưa đã phơi khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng etanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao khô, xác định khối lượng cặn khô, sau đó thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung môi: n-hexan, etylaxetat, đuổi hết nước và chiết bằng butanol, tiếp tục đuổi hết nước và chiết bằng metanol.
Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt dung môi bằng cô quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 500 C. Cặn được sấy khô và cân để xác định trọng lượng. Như vậy từ toàn bộ phần trên mặt đất của cây chó đẻ răng cưa đã thu nhận được 4 phân đoạn là n-hexan, etylaxetat,
chiều dài di chuyển của chất thử chiều dài di chuyển của dung môi
26
butanol và metanol với các ký hiệu tương ứng là: cặn trong n-hexan (PH), cặn trong etylaxetat (PE), cặn trong butanol (PB) và cặn trong metanol (PM).
Sơ đồ 2.1: Quy trình ngâm chiết mẫu
1. Etanol
2. Cặn trong nước
n-Hexan EtOAc BuOH MeOH
Bảng 2.1: Khối lƣợng chất tổng số đƣợc chiết từng phân đoạn của cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L)
Khối lƣợng nguyên liệu khô
(g)
Khối lƣợng cặn cồn tổng
số (g)
Khối lƣợng cặn chiết (g)
n-Hexan Etylaxetat n-Butanol Metanol
1230 302,05 37,01 24,95 26,14 50,28 MẪU KHÔ Cặn n-Hexan (PH) Cặn BuOH (PB) Cặn EtOAc (PE) Cặn MeOH (PM)
PE-1 PE-2 PE-3
27
2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết
Trên cơ sở dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lý cao trong thực vật [2] chúng tôi thu được kết quả thử định tính với các nhóm chất, kết quả ấy được chỉ ra ở bảng 2.2:
Bảng 2.2: Phát hiện các nhóm chất trong cây chó đẻ răng cƣa
STT Nhóm chất Thuốc thử
đặc hiệu Hiện tƣợng
Kết quả
1 Đường khử Felinh Cho kết tủa màu đỏ gạch ++
2 Ankaloit Dragendorf Màu vàng da cam +
3 Steroit Liberman-Bourchard Màu xanh vàng ++
4 Flavonoit Xianidin Từ hồng đến đỏ ++
5 Polifenol FeCl3 Xanh thẫm ++
6 Cumarin Axit và kiềm Kết tủa bông ++
7 Glycozit tim Kelle-Kiliani Không có hiện tượng gì -
8 Saponin Tạo bọt Bọt bền trong axit ++
Ghi chú: Dấu (+): Phản ứng dương tính, (++): Phản ứng dương tính rất rõ; (-): Không có.
2.3.3. Thử hoạt tính sinh học
Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định.
Thử định tính theo phương pháp khuyếch tán trên thạch, sử dụng khoang giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn.
28
Hình 2.1: Đƣờng kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm) theo phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch
29
Các chủng vi sinh vật gồm đại diện các nhóm:
* Vi khuẩn Gr(-) Escherichia coli
* Vi khuẩn Gr(+) Staphylococcus auresu
* Vi khuẩn: Salmonella typhi
Chúng tôi đã tiến hành thử các ứng dụng làm thực phẩm chức năng của dịch chiết cây chó đẻ răng cưa tại Cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành phẩm, thực phẩm chức năng Y học cổ truyền Thái Nguyên.
Tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của dược liệu tại bộ môn Vi Sinh trường Đại học Y Thái Nguyên.
Kết quả thực nghiệm thu được (xem hình 2.1).
Bảng 2.3: Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô từ cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L)
Dịch chiết
Đƣờng kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm)
Staphylococcusauresu E.coli Salmonella typhi
Cặn nước 34 23 40
Cặn EtOAc 29 18 32
2.4. Phân lập, tinh chế các chất từ cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L) urinaria L)
2.4.1. Dịch chiết n-hexan
Từ 2g cặn dịch n-hexan của toàn bộ phần trên mặt đất của cây chó đẻ răng cưa. Kí hiệu (PH) được tiến hành phân lập các chất trên sắc kí cột silicagel. Hệ dung môi rửa giải là n-hexan : etylaxetat với tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi phân cực từ 0 đến 100% etylaxetat, kiểm tra các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng, các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi đã thu được chất sạch.
30
* Chất PH-1 (β-Sitosterol)
Tiến hành phân chia nhờ sắc kí cột bằng hệ dung môi n-hexan - etylaxetat (9:1). Sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi A, phát hiện nó bằng vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 5%, kết tinh lại trong n-hexan thu được 19 mg chất rắn, có nhiệt độ nóng chảy ở 139-1410
C, Rf = 0,72 (trong hệ dung môi A). Tiến hành đo phổ chất PH-1 thu được các thông tin phổ như sau:
Phổ FT-IR (KBr); (cm-1): Ở max = 3450 (cm-1) cho một vân hấp thụ rộng (H32,C3); một vân hấp thụ ở 3010- 1650 (cm-1) (liên kết đôi).
Phổ EI-MS; m/z(%): 414 [M+ ] (20); 413[M-H]+(41); 398(28); 397(100); 395(32); 383(11); 361(11); 257(3); 255(6,3); 151(5,6); 139(11). Phổ 1 H-NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 0,68 ppm (3H, s, CH3-18); 1,01 ppm (3H, s, CH3-19); 0,81 ppm (3H, d, j 7Hz, CH3-26); 0,88 ppm (3H, d, j 7Hz, CH3-27); 0,83 ppm (3H, t, 7,32Hz, CH3-29); 0,92 ppm (3H, d, j 10Hz, CH3-21); 3,52 ppm (1H, m, H-3); 5,42 ppm (1H, d, j 5Hz,H-6). Phổ 13C- NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): Xem bảng 2.4. Bảng 2.4: Số liệu phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của chất PH-1
trong cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L) STT của C 13 C-NMR (δ-ppm) STT của C 13 C-NMR (δ-ppm) 1 37,2 t 16 28,3 t 2 31,7 t 17 56,2 d 3 71,8 d 18 11,9 q 4 42,3 t 19 19,4 q 5 140,8 s 20 36,2 d 6 121,7 d 21 18,8 q 7 31,9 t 22 33,9 t 8 31,9 d 23 26,1 t 9 50,1 d 24 45,8 d 10 36,5 s 25 29,2 d 11 21,1 t 26 19,1 q 12 39,8 t 27 19,4 d 13 42,3 s 28 23,1 t 14 56,8 d 29 11,9 q 15 24,3 t - - -
31
2.4.2 Dịch chiết etylaxetat (PE)
Từ 5g cặn chiết etylaxetat của cây chó đẻ răng cưa (ký hiệu PE) được tiến hành tách các chất trên sắc kí cột silicagel, rửa giải cột sắc kí bằng hệ dung môi cloroform : metanol có tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi phân cực, từ 0-100% metanol, kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng, thuốc thử phát hiện (FeCl3 + K3[Fe(CN)6]) 1% sau đó gộp các phân đoạn giống nhau, đuổi hết dung môi và kết tinh lại thu được 3 cặn thô. Tinh chế hai cặn đầu thu được hai chất: PE-1và PE-2. Cặn thứ ba được tách tiếp bằng hệ dung môi toluen : etylaxetat : axit formic (5:4:1) thu được chất PE-3.
2.4.2.1 Chất PE-1(5-hidroxymetylfurfural)
Rửa giải cột bằng hệ dung môi cloroform : metanol (90:10). Những phân đoạn có cùng Rf =0,8 trong hệ dung môi C được gộp lại, thu được cặn thô. Tinh chế lại cặn này trong CHCl3 thu được 8 mg một chất dầu sệt mầu nâu.
Tiến hành đo phổ chất PE-1 thu được các thông tin phổ như sau: Phổ LC- MS; m/z(%): Cho pic M+ = 126,8. Phổ 1 H-NMR (500MHz, DMSO); (ppm): δH = 7,48 ppm (1H,d, CH-3); δH= 4,50 ppm (2H, d, CH2-6); δH= 6,60 ppm (1H,d, J=3,6 Hz, CH-4); δH= 9,54 ppm (1H,s,CHO-1). Phổ 13
C- NMR (500MHz, DMSO); (ppm): Cho các pic ở δC = 177,91 ppm (C1); δC = 151,70 ppm (C2); δC = 124,33 ppm (C3); δC =109,62 ppm (C4); δC = 162,13 ppm (C5); δC = 55,89 ppm (C6).
2.4.2.2 Chất PE-2 (axit gallic)
Chất PE-2 cũng được tách từ cặn etylaxetat. Những phân đoạn tiếp theo giống nhau có cùng Rf = 0,7 (trong hệ dung môi C) được gộp lại, đem cất đuổi dung môi thu được một chất rắn kết tinh. Tinh chế lại bằng cloroform thu được 40 mg tinh thể hình kim màu vàng có nhiệt độ nóng chảy ở 249-250o
C. Phổ 1
H-NMR (500MHz, DMSO); (ppm): Cho một pic ở 6,91ppm. Phổ 13
32
δC = 108,73 ppm (C2 và C6); δC = 145,40 ppm (C3 và C5); δC = 137,98 ppm (C4); δC = 167,46 ppm (C7).
2.4.2.3 Chất PE-3 (Kampherol)
Sau khi rửa giải cột bằng hệ cloroform : metanol (90:10) thu được hai chất PE-1 và PE-2. Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi chloroform : metanol (50:10), thu được một một hỗn hợp có màu vàng có cùng Rf = 0,65 (trong hệ dung môi D).
Hỗn hợp này cho màu đỏ cam với phản ứng xianiđin, màu xanh đen với dung dịch FeCl3 1% điều đó nói lên trong hỗn hợp này có flavonoit.
Hỗn hợp này tiếp tục được phân chia bằng phương pháp sắc kí cột silicagel rửa giải bằng hệ dung môi toluen : etylaxetat : axit fomic (5:4:1) thu được 29mg chất rắn màu vàng (có Rf =0,4 trong hệ E), nóng chảy ở 276- 278oC.
Phổ LC- MS; m/z(%): Cho pic ion phân tử M+
ở m/z =286,9 và M- ở m/z =285,0. Các số liệu của phổ 1 H-NMR (500MHz, DMSO); (ppm) và phổ 13 C- NMR (500MHz, DMSO); (ppm) (xem bảng 2.5): Bảng 2.5:Phổ 1 H-NMR và 13C-NMR của chất PE-3 Vị trí C 13 C-NMR (δ-ppm) 1 H-NMR (δ-ppm, J-Hz) Vị trí C 13 C-NMR (δ-ppm) 1 H-NMR (δ-ppm, J-Hz) 2 147,03 __ 10 104,15 __ 3 136,52 __ 1/ 123,32 __
33 4 176,58 __ 2/ 130,44 8,15 (1H,dd, J=8,2; 2,2) 5 157,78 __ 3/ 116,32 7,01(1H,dd, J=8,2;2,2) 6 99,17 6,26 (1H, d, J=2,1) 4 / 160,16 __ 7 164,98 __ 5/ 116,32 7,01(1H,dd, J=8,2; 2,2) 8 94,49 6,52 (1H, d, J=2,1) 6 / 130,44 8,15 (1H,dd, J=8,2; 2,2) 9 162,30 __ __ __ __
34
CHƢƠNG III
THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Nguyên tắc chung
Để phân lập được các hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà không làm ảnh hưởng tới thành phần hoá học có trong nó thì trước khi ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ, mẫu thực vật phải được đưa đi khử men ngay sau khi thu mẫu và sấy khô ở điều kiện thích hợp.
Về nguyên tắc việc ngâm chiết mẫu thực vật có thể tiến hành theo 2 cách phổ biến sau.
1. Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: ete dầu hỏa hoặc n-hexan, cloroform, etylaxetat, metanol hoặc etanol vv...
2. Chiết tổng bằng các ancol (metanol, etanol) hay hệ dung môi ancol : nước. Sau đó sàng lọc các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần như phương pháp 1 để thu được các dịch chiết có chứa các hợp chất có độ phân cực tương đối giống nhau.
Việc chiết mẫu thực vật chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) được thực hiện theo phương án 2 (Sơ đồ 2.1).
Các dịch chiết thô đem thử hoạt tính sinh học. Điều đó giúp cho việc định hướng tìm kiếm các hoạt chất trong những dịch chiết có hoạt tính mạnh với các chủng vi khuẩn đã thử nghiệm.
3.2. Xác định định tính các nhóm chất thiên nhiên
Phân tích định tính các hợp chất hữu cơ thiên nhiên trong các mẫu nghiên cứu là việc làm cần thiết trước khi tiến hành phân lập và xác định cấu trúc của các chất cụ thể.
35
Để xác định định tính các nhóm hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh lí cao có trong thực vật thường dùng hơn cả là phân tích bằng các phản ứng đặc trưng đối với mỗi nhóm chất đã nêu ra ở bảng 2.2. Từ kết quả chỉ ra ở bảng này có thể nhận thấy trong cây Phyllanthus urinaria L ít nhất có chưa tới 7 nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng đó là: đường khử, poliphenol, flavonoit, cumarin, steroit, saponintritecpen và ankaloit. Không phát hiện thấy glycozit tim có trong các mẫu thử. Từ kết quả phân tích định tính cũng sơ bộ cho thấy cây chó đẻ răng cưa là một loài thực vật chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học cao, có lợi cho sức khỏe con người.
3.3. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây chó đẻ răng cƣa nhau của cây chó đẻ răng cƣa
Các dịch chiết từ cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp, đã sử dụng các phương pháp sắc ký cột như: Cột với chất hấp phụ silicagel, với các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần. Việc tinh chế các chất thường dùng phương pháp kết tinh lại trong dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp. Nhờ đó sẽ thu được các hợp chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng các nhu cầu để khảo sát tính chất hóa lý và quang phổ của chúng. Đó là những yếu tố quan trọng trong quá trình nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất đã phân lập được từ các đối tượng nghiên cứu nói trên. Việc phân lập các thành phần hóa học từ cây chó