Từ 2g cặn dịch n-hexan của toàn bộ phần trên mặt đất của cây chó đẻ răng cưa. Kí hiệu (PH) được tiến hành phân lập các chất trên sắc kí cột silicagel. Hệ dung môi rửa giải là n-hexan : etylaxetat với tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi phân cực từ 0 đến 100% etylaxetat, kiểm tra các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng, các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi đã thu được chất sạch.
30
* Chất PH-1 (β-Sitosterol)
Tiến hành phân chia nhờ sắc kí cột bằng hệ dung môi n-hexan - etylaxetat (9:1). Sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi A, phát hiện nó bằng vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 5%, kết tinh lại trong n-hexan thu được 19 mg chất rắn, có nhiệt độ nóng chảy ở 139-1410
C, Rf = 0,72 (trong hệ dung môi A). Tiến hành đo phổ chất PH-1 thu được các thông tin phổ như sau:
Phổ FT-IR (KBr); (cm-1): Ở max = 3450 (cm-1) cho một vân hấp thụ rộng (H32,C3); một vân hấp thụ ở 3010- 1650 (cm-1) (liên kết đôi).
Phổ EI-MS; m/z(%): 414 [M+ ] (20); 413[M-H]+(41); 398(28); 397(100); 395(32); 383(11); 361(11); 257(3); 255(6,3); 151(5,6); 139(11). Phổ 1 H-NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 0,68 ppm (3H, s, CH3-18); 1,01 ppm (3H, s, CH3-19); 0,81 ppm (3H, d, j 7Hz, CH3-26); 0,88 ppm (3H, d, j 7Hz, CH3-27); 0,83 ppm (3H, t, 7,32Hz, CH3-29); 0,92 ppm (3H, d, j 10Hz, CH3-21); 3,52 ppm (1H, m, H-3); 5,42 ppm (1H, d, j 5Hz,H-6). Phổ 13C- NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): Xem bảng 2.4. Bảng 2.4: Số liệu phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của chất PH-1
trong cây chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L) STT của C 13 C-NMR (δ-ppm) STT của C 13 C-NMR (δ-ppm) 1 37,2 t 16 28,3 t 2 31,7 t 17 56,2 d 3 71,8 d 18 11,9 q 4 42,3 t 19 19,4 q 5 140,8 s 20 36,2 d 6 121,7 d 21 18,8 q 7 31,9 t 22 33,9 t 8 31,9 d 23 26,1 t 9 50,1 d 24 45,8 d 10 36,5 s 25 29,2 d 11 21,1 t 26 19,1 q 12 39,8 t 27 19,4 d 13 42,3 s 28 23,1 t 14 56,8 d 29 11,9 q 15 24,3 t - - -
31
2.4.2 Dịch chiết etylaxetat (PE)
Từ 5g cặn chiết etylaxetat của cây chó đẻ răng cưa (ký hiệu PE) được tiến hành tách các chất trên sắc kí cột silicagel, rửa giải cột sắc kí bằng hệ dung môi cloroform : metanol có tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi phân cực, từ 0-100% metanol, kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng, thuốc thử phát hiện (FeCl3 + K3[Fe(CN)6]) 1% sau đó gộp các phân đoạn giống nhau, đuổi hết dung môi và kết tinh lại thu được 3 cặn thô. Tinh chế hai cặn đầu thu được hai chất: PE-1và PE-2. Cặn thứ ba được tách tiếp bằng hệ dung môi toluen : etylaxetat : axit formic (5:4:1) thu được chất PE-3.
2.4.2.1 Chất PE-1(5-hidroxymetylfurfural)
Rửa giải cột bằng hệ dung môi cloroform : metanol (90:10). Những phân đoạn có cùng Rf =0,8 trong hệ dung môi C được gộp lại, thu được cặn thô. Tinh chế lại cặn này trong CHCl3 thu được 8 mg một chất dầu sệt mầu nâu.
Tiến hành đo phổ chất PE-1 thu được các thông tin phổ như sau: Phổ LC- MS; m/z(%): Cho pic M+ = 126,8. Phổ 1 H-NMR (500MHz, DMSO); (ppm): δH = 7,48 ppm (1H,d, CH-3); δH= 4,50 ppm (2H, d, CH2-6); δH= 6,60 ppm (1H,d, J=3,6 Hz, CH-4); δH= 9,54 ppm (1H,s,CHO-1). Phổ 13
C- NMR (500MHz, DMSO); (ppm): Cho các pic ở δC = 177,91 ppm (C1); δC = 151,70 ppm (C2); δC = 124,33 ppm (C3); δC =109,62 ppm (C4); δC = 162,13 ppm (C5); δC = 55,89 ppm (C6).
2.4.2.2 Chất PE-2 (axit gallic)
Chất PE-2 cũng được tách từ cặn etylaxetat. Những phân đoạn tiếp theo giống nhau có cùng Rf = 0,7 (trong hệ dung môi C) được gộp lại, đem cất đuổi dung môi thu được một chất rắn kết tinh. Tinh chế lại bằng cloroform thu được 40 mg tinh thể hình kim màu vàng có nhiệt độ nóng chảy ở 249-250o
C. Phổ 1
H-NMR (500MHz, DMSO); (ppm): Cho một pic ở 6,91ppm. Phổ 13
32
δC = 108,73 ppm (C2 và C6); δC = 145,40 ppm (C3 và C5); δC = 137,98 ppm (C4); δC = 167,46 ppm (C7).
2.4.2.3 Chất PE-3 (Kampherol)
Sau khi rửa giải cột bằng hệ cloroform : metanol (90:10) thu được hai chất PE-1 và PE-2. Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi chloroform : metanol (50:10), thu được một một hỗn hợp có màu vàng có cùng Rf = 0,65 (trong hệ dung môi D).
Hỗn hợp này cho màu đỏ cam với phản ứng xianiđin, màu xanh đen với dung dịch FeCl3 1% điều đó nói lên trong hỗn hợp này có flavonoit.
Hỗn hợp này tiếp tục được phân chia bằng phương pháp sắc kí cột silicagel rửa giải bằng hệ dung môi toluen : etylaxetat : axit fomic (5:4:1) thu được 29mg chất rắn màu vàng (có Rf =0,4 trong hệ E), nóng chảy ở 276- 278oC.
Phổ LC- MS; m/z(%): Cho pic ion phân tử M+
ở m/z =286,9 và M- ở m/z =285,0. Các số liệu của phổ 1 H-NMR (500MHz, DMSO); (ppm) và phổ 13 C- NMR (500MHz, DMSO); (ppm) (xem bảng 2.5): Bảng 2.5:Phổ 1 H-NMR và 13C-NMR của chất PE-3 Vị trí C 13 C-NMR (δ-ppm) 1 H-NMR (δ-ppm, J-Hz) Vị trí C 13 C-NMR (δ-ppm) 1 H-NMR (δ-ppm, J-Hz) 2 147,03 __ 10 104,15 __ 3 136,52 __ 1/ 123,32 __
33 4 176,58 __ 2/ 130,44 8,15 (1H,dd, J=8,2; 2,2) 5 157,78 __ 3/ 116,32 7,01(1H,dd, J=8,2;2,2) 6 99,17 6,26 (1H, d, J=2,1) 4 / 160,16 __ 7 164,98 __ 5/ 116,32 7,01(1H,dd, J=8,2; 2,2) 8 94,49 6,52 (1H, d, J=2,1) 6 / 130,44 8,15 (1H,dd, J=8,2; 2,2) 9 162,30 __ __ __ __
34
CHƢƠNG III
THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Nguyên tắc chung
Để phân lập được các hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà không làm ảnh hưởng tới thành phần hoá học có trong nó thì trước khi ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ, mẫu thực vật phải được đưa đi khử men ngay sau khi thu mẫu và sấy khô ở điều kiện thích hợp.
Về nguyên tắc việc ngâm chiết mẫu thực vật có thể tiến hành theo 2 cách phổ biến sau.
1. Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: ete dầu hỏa hoặc n-hexan, cloroform, etylaxetat, metanol hoặc etanol vv...
2. Chiết tổng bằng các ancol (metanol, etanol) hay hệ dung môi ancol : nước. Sau đó sàng lọc các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần như phương pháp 1 để thu được các dịch chiết có chứa các hợp chất có độ phân cực tương đối giống nhau.
Việc chiết mẫu thực vật chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) được thực hiện theo phương án 2 (Sơ đồ 2.1).
Các dịch chiết thô đem thử hoạt tính sinh học. Điều đó giúp cho việc định hướng tìm kiếm các hoạt chất trong những dịch chiết có hoạt tính mạnh với các chủng vi khuẩn đã thử nghiệm.
3.2. Xác định định tính các nhóm chất thiên nhiên
Phân tích định tính các hợp chất hữu cơ thiên nhiên trong các mẫu nghiên cứu là việc làm cần thiết trước khi tiến hành phân lập và xác định cấu trúc của các chất cụ thể.
35
Để xác định định tính các nhóm hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh lí cao có trong thực vật thường dùng hơn cả là phân tích bằng các phản ứng đặc trưng đối với mỗi nhóm chất đã nêu ra ở bảng 2.2. Từ kết quả chỉ ra ở bảng này có thể nhận thấy trong cây Phyllanthus urinaria L ít nhất có chưa tới 7 nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng đó là: đường khử, poliphenol, flavonoit, cumarin, steroit, saponintritecpen và ankaloit. Không phát hiện thấy glycozit tim có trong các mẫu thử. Từ kết quả phân tích định tính cũng sơ bộ cho thấy cây chó đẻ răng cưa là một loài thực vật chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học cao, có lợi cho sức khỏe con người.
3.3. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây chó đẻ răng cƣa nhau của cây chó đẻ răng cƣa
Các dịch chiết từ cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp, đã sử dụng các phương pháp sắc ký cột như: Cột với chất hấp phụ silicagel, với các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần. Việc tinh chế các chất thường dùng phương pháp kết tinh lại trong dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp. Nhờ đó sẽ thu được các hợp chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng các nhu cầu để khảo sát tính chất hóa lý và quang phổ của chúng. Đó là những yếu tố quan trọng trong quá trình nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất đã phân lập được từ các đối tượng nghiên cứu nói trên. Việc phân lập các thành phần hóa học từ cây chó đẻ răng cưa được thực hiện như sơ đồ 2.1 và đã thu được các hợp chất sạch gồm các nhóm chất: tritecpenoit, furan, axit gallic và flavonoit.
3.3.1. -sitosterol (PH-1)
Từ cặn của dịch chiết n-hexan phân chia trên sắc ký cột silicagel, rửa rải bằng hệ dung môi n-hexan : etylaxetat (9:1) thu được chất PH-1 có Rf = 0,72.
36
37
38
Hình 3.3: Phổ 13
39
Chất PH-1 là những tinh thể hình kim, không màu, điểm nóng chảy ở 139-1410C. Khi trộn lẫn với chất chuẩn cho một hỗn hợp có nhiệt độ nóng chảy không thay đổi.
Chất PH-1 trong phổ EI-MS cho mảnh ion phân tử M+
= 414, như vậy có nghĩa khối lượng phân tử bằng 414 đvC sẽ ứng với công thức phân tử C29H50O.
Trong phân tử có một nhóm OH thể hiện ở phổ FT-IR với vân hấp thụ rộng ở ν = 3380cm-1
. Mặt khác phổ 1
H-NMR cho δ = 3,52 ppm đặc trưng cho proton trong nhóm CH liên kết với nhóm hidroxyl.
Phổ 13
C-NMR cũng nhận thấy δ = 71,7 ppm đặc trưng cho cacbon liên kết trực tiếp với oxy của nhóm hidroxyl.
Trong phân tử còn có một nối đôi thể hiện bởi các đặc trưng ở phổ FT- IR có vân ở 3010 cm-1
đặc trưng cho dao động hoá trị của liên kết C-H và vân ở 1650 cm-1đặc trưng cho dao động hoá trị của liên kết đôi C=C. Trong phổ 1
H- NMR cũng nhận được tín hiệu δ = 5,35 ppm đặc trưng cho H trong liên kết =C- H và tín hiệu của 2 cacbon mang nối đôi với δ= 140,7 ppm và δ= 121,5 ppm từ đó có thể quy kết hợp chất PH-1 có một nối đôi giữa vị trí C-5 và C-6.
So sánh phổ 1
H-NMR và phổ 13C-NMR của chất PH-1 với phổ của β- Sitosterol thấy hoàn toàn tương tự nhau (bảng 3.1). Từ các kết quả phân tích thành phần hoá học, tính chất vật lý, tính chất quang phổ nhất là dựa trên cơ sở so sánh các số liệu phổ của chất PH-1 với phổ của chất β-sitosterol hoàn toàn có thể cho phép quy kết chất PH-1 đã phân lập được từ cây chó đẻ răng cưa là β-sitosterol.
40
Bảng 3.1: Số liệu phổ 13
C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của PH-1 trong cây
chó đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L) và phổ của -sitosterol [15]
Chất PH-1 β-Sitosterol [15] Vị trí C δ của 13 C (ppm) Vị trí C δ của 13 C (ppm) 1 37,2 1 37,2 2 31,7 2 31,6 3 71,8 3 71,7 4 42,3 4 42,3 5 140,8 5 140,7 6 121,7 6 121,7 7 31,9 7 31,9 8 31,9 8 31,9 9 50,1 9 50,1 10 36,5 10 36,5 11 21,1 11 21,2 12 39,8 12 39,8 13 42,3 13 42,3 14 56,8 14 56,7 15 24,3 15 24,3 16 28,3 16 28,2 17 56,2 17 56,1 18 11,9 18 11,9 19 19,4 19 19,4 20 36,2 20 36,1 21 18,8 21 18,9 22 33,9 22 34,0 23 26,1 23 26,1 24 45,8 24 45,8 25 29,2 25 29,2 26 19,1 26 19,8 27 19,4 27 19,5 28 23,1 28 23,0 29 11,9 29 12,0
41 2 3 4 5 10 1 6 7 8 9 13 12 17 16 21 22 24 28 29 26 27 19 18 HO 11 14 15 20 23 25 β-Sitosterol 3.3.2.5-Hydroxymetylfufural (PE-1)
Chất PE-1 được tách từ cặn etylaxetat có Rf= 0,8 (trong hệ dung môi cloroform : etylaxetat (9:1). Nó là chất dầu sệt màu nâu.
Phổ LC-MS cho biết chất PE-1 có píc ion phân tử M+
= 126,8 điều này cho thấy chất PE-1 có khối lượng phân tử 126 đvC.
Các dữ liệu phổ NMR cũng xác nhận những thông tin quan trọng. Phổ 13
C-NMR cho tín hiệu δ = 177,91 ppm, đó chính là độ chuyển dịch hóa học của cacbon cacbonyl. Ở độ chuyển dịch hóa học δ = 124,31 ppm và δ = 109,62 ppm là độ chuyển dịch của hai nguyên tử cacbon chưa no liên kết với hiđro (=C-H), có thể quy kết δ = 124,31 ppm là C-3 còn δ = 109,62 ppm là của C-4.
Từ phổ NMR kỹ thuật DEPT cho thấy có một số loại các bon như sau: hai cacbon bậc 4 ở độ chuyển dịch hóa học 151,70 ppm và 162,13 ppm đó là các nguyên tử cacbon C-2 và C-5. Có một nhóm CH2 với δ = 55,89 ppm. Có hai nhóm CH (metin) ở các độ dịch chuyển hóa học 109,62 ppm và 124,31 ppm. Theo phổ HSQC thì nguyên tử H-1 có độ dịch chuyển hóa học ở 9,54 ppm, các nguyên tử H-6a,b có độ dịch chuyển hóa học ở 4,50 ppm, nguyên tử H-3 có độ dịch chuyển hóa học ở 7,48 ppm. Còn nguyên tử H-4 có độ dịch chuyển hóa học ở 6,60 ppm.
42
43
44
Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của PE-1 và số liệu phổ NMR trong phần mềm ACD/NMR của hidroxymetylfufural
Vị trí C
Phổ của chất PE-1 Phần mềm ACD của
hidroxymetylfufural. 13 C- NMR (ppm) 1 H-NMR (ppm) ACD/ 13 C-NMR ACD/1H-NMR 1 177,91 9,54 179,55 9,53 2 151,70 - 156,33 - 3 124,31 7,48 121,65 7,41 4 109,62 6,60 112,74 6,68 5 162,13 - 160,22 - 6 55,89 4,50 56,63 4,70 Phân tích phổ 1
H-NMR, HMBC cho thấy tín hiệu H-1 (δ = 9,54 ppm) là độ chuyển dịch hóa học của hiđtro liên kết với nhóm C=O có tương tác xa với C-2 ở độ dịch chuyển hóa học ở 151,70 ppm và C-3 ở 124,31 ppm, H-3 (δ = 7,48ppm) có tương tác xa với các cacbon C-2 ở 151,70 ppm và C-4 ở 109,62 ppm, H-4 (1H, d, j=3,7Hz; δ = 6,60 ppm) có tương tác xa với C-3 và C-5 ở các độ dịch chuyển hóa học 124,31 ppm và 162,13 ppm. Còn các nguyên tử H-6a,b có tương tác xa với C-4 và C-5 ở các độ dịch chuyển hóa học 109,62 ppm và 162,13 ppm.
So sánh phổ NMR của chất PE-1 với phần mềm ACD/1
H-NMR và ACD/13C-NMR cho thấy sự tương tự gần như hoàn toàn với phổ của 5- hidroxymetylfufural (xem bảng 3.2).
45
Từ các kết quả phân tích các loại phổ của hợp chất PE-1như: phổ khối, phổ NMR với các kỹ thuật đo 1D và 2D, có so sánh với phần mềm mô phỏng ACD/NMR, có thể khẳng định chất PE-1 là 5-hidroxymetylfufural.
1 2 3 4 5 6 O C O H HO 5-Hidroxymetylfufural
Ngày nay chất 5-hidroxymetylfufural đã được phân lập từ một số cây thuốc dân gian khác như từ cây địa hoàng, cây trinh nữ hoàng cung nó có vai trò trong quá trình chuyển hoá chất trong cơ thể sinh vật. Trong cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria), chất 5-hidroxymetylfufural lần đầu tiên được phân lập và nhận dạng cấu trúc phân tử.
3.3.3. Axit gallic (PE-2)
Chất PE-2 cũng được tách từ cặn etylaxetat, là chất rắn kết tinh, tinh thể hình kim màu vàng có nhiệt độ nóng chảy ở 249-250o
C. Phổ 1
H-NMR cho tín hiệu 7,092 ppm ứng với 2 proton đặc trưng cho độ chuyển dịch hóa học của các proton vòng thơm, được quy kết cho các proton ở các vị trí C-2 và C-6.
Phổ 13C-NMR cho thấy các độ chuyển dịch hóa học ở δ = 120,48 ppm, δ = 137,98 ppm và δ = 167,46 ppm, tương ứng với độ chuyển dịch hóa học của các nguyên tử cacbon C1, C4 và C7 trong axit gallic. Có 2 tín hiệu ở δ = 108,73 ppm và δ = 145,40 ppm, mỗi tín hiệu ứng với 2 nguyên tử cacbon. Các tín hiệu này phù hợp với độ chuyển dịch hóa học của C2 và C6 (δ= 108,73 ppm) và của C3 và C5 (δ= 145,40 ppm).
46
47
48
So sánh phổ NMR của chất PE-2 với phần mềm ACD/1