VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Thí nghiệm 1: thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matr
nhiệt và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix
Để ly trích ADN, cĩ hai quy trình đã được thử nghiệm:
- Quy trình 1: ly trích ADN sử dụng SDS, NaOH, và sốc nhiệt.
- Quy trình 2: ly trích ADN sử dụng Instagene Matrix sau khi đã ly trích bằng SDS, NaOH, và sốc nhiệt.
Mục đích
Khảo sát hai quy trình ly trích nhằm tìm ra quy trình ly trích tối ưu. Tiến hành
Sử dụng mẫu tơm nhiễm WSSV với mức độ nặng (đã qua xét nghiệm) được lưu trữ tại cơng ty Nam Khoa để tiến hành tách chiết ADN theo hai quy trình ly trích (chi tiết ở mục 3.4.2). Sau khi ly trích xong, dịch tách chiết ADN được pha lỗng theo hệ số pha lỗng bậc 10. Dùng micropipette hút 5 µl dịch tách chiết ADN cho vào 45 µl dung dịch TE 1X (Tris EDTA), tiến hành trộn mẫu trên máy vortex, sau đĩ hút 5 µl mẫu từ ống eppendorf vừa vortex ở trên chuyển sang ống eppendorf thứ hai cĩ chứa sẵn 45 µl TE 1X, trộn đều. Quá trình cứ lặp lại, cuối cùng ta thu được một dãy các nồng độ ADN theo chiều giảm dần từ 100 đến 10-6 (Hình 3.8). Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR cho tất cả các nồng độ từ 10-1 đến 10-6 của cả hai quy trình ly trích.
633bp
221bp
Hình 3.7 Kết quả điện di qua Non Stop Nested PCR
Dựa vào kết quả so sánh chu kỳ ngưỡng của mẫu ở từng nồng độ pha lỗng theo hai quy trình ly trích để xác định mẫu ly trích theo quy trình nào sẽ cĩ ADN đích nhiều và tinh sạch hơn (mẫu cĩ ADN đích nhiều và tinh sạch hơn sẽ cĩ chu kỳ ngưỡng thấp hơn).