VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.2. Thí nghiệm 2: sử dụng phƣơng pháp Real time PCR kiểm tra phát hiện và định lƣợng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dƣơng
và định lƣợng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dƣơng tính, âm tính với WSSV
Mục đích
Thử nghiệm khả năng phát hiện và định lượng WSSV bằng phương pháp Real - time PCR.
Tiến hành
15 mẫu tơm (8 mẫu dương tính và 7 mẫu âm tính với WSSV) đã qua kiểm tra PCR và Semi – Nested PCR được tiến hành ly trích theo quy trình xác định từ thí nghiệm 1. Các mẫu này được thử nghiệm lặp lại hai lần qua Real - time PCR và đồng thời một lần qua Non Stop Nested PCR. Các mẫu tơm sau khi ly trích này được chạy kèm với 5 chuẩn. Sau khi ly trích xong, dùng micropipette hút 2 µl dịch tách chiết chứa ADN của WSSV cho vào từng hỗn hợp 48 µl Real - time PCR và hỗn hợp 48 µl Non Stop Nested PCR. Đối với chuẩn, hút 2 µl mỗi chuẩn cho vào 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR và Non Stop Nested PCR (chi tiết ở mục 3.4.3 và 3.4.4).
Mẫu nào cĩ đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang vượt qua đường baseline subtracted được xác định là dương tính với WSSV. Mẫu nào cĩ đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang nằm dưới đường baseline subtracted được xác định là âm tính với
5 µl mẫu
45 µl TE
100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl
Hình 3.7 : Cách pha lỗng mẫu theo hệ số pha lỗng bậc 10
Hình 3.8 Cách pha lỗng mẫu theo hệ số pha lỗng bậc 10