3.3.1.1. Tách chiết RNA bằng Trizol
Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số bằng Trizol theo Peter Walker và cộng sự (2000).
Nghiền khoảng 100 mg mơ trong 1ml Trizol. Ủ nhiệt độ phịng trong 5 phút. Thêm vào 200 l Chloroform. Vortex 20 giây. Ủ ở nhiệt độ phịng trong 3 phút. Ly tâm 12000 vịng/phút trong 10 phút. Thu dịch nổi cĩ chứa RNA vào ống eppendorf 1,5 ml khác (hút khoảng 600 l cho mỗi ống).Thêm vào mỗi ống 600 l Isopropanol lạnh. Ủ nhiệt độ phịng trong 10 phút (qua đêm - 200C hay để - 700C trong 1 giờ). Ly tâm 12000 vịng trong 10 phút. Loại bỏ dung dịch nổi. Rửa cặn RNA bằng 1 ml Ethanol 70%. Vortex, ly tâm 7500 vịng trong 5 phút. Loại bỏ dung dịch nổi. Làm khơ cặn RNA ở 550C. Hịa cặn RNA trong 50 l H20 - DEPC. Sau đĩ bảo quản - 200C.
3.3.1.2. Tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation kit (Bio - Rad)
Lấy 5 - 10 mg mơ tƣơi. Nghiền mẫu trong eppendorf với 300 l RNA Lysis. Thêm vào 100 l dung dịch Protein - DNA để phá vỡ tế bào. Đảo ngƣợc ống 10 lần và ủ trên nƣớc đá 5 phút. Ly tâm lạnh (40C) ở 13000 vịng trong 6 phút, kết tủa protein và DNA sẽ cĩ màu trắng. Hút dung dịch nổi chứa RNA (loại bỏ lớp dƣới) vào eppendorf 1,5 ml sạch chứa 300 l 100% Isopropanol (trên đá). Đảo ngƣợc ống 20 - 25 lần. Ly tâm 13000 vịng trong 6 phút (40C) (RNA sẽ thấy dƣới dạng kết tủa sáng). Đổ bỏ dung dịch nổi và làm ráo nƣớc trên giấy thấm, cho vào 300 l 70% ethanol và đảo ống vài lần để rửa RNA. Ly tâm ở 13000 vịng trong máy ly tâm khoảng 2 phút (40C). Đảo và làm ráo nƣớc trên giấy thấm sạch và cho khơng khí làm khơ 10 - 15 phút. Thêm 50 l dung dịch RNA Hydration. Ủ 30 phút trên nƣớc đá (hoặc trữ - 700
C -> - 800C đến khi sử dụng). Trƣớc khi sử dụng vortex mạnh 5s và spin down hoặc trộn mẫu lên xuống vài lần.
3.3.2. Phƣơng pháp SINGLE - STEP RT - PCR trên RNA của MrNV, XSV
Trƣớc khi tiến hành phiên mã ngƣợc, RNA bản mẫu phải biến tính ở 700C trong 10 phút nhằm phá vỡ tồn bộ cấu trúc bậc một và hai cho RNA của từng virus.
Tiếp đĩ, quá trình phiên mã ngƣợc đƣợc tiến hành cho hai Mix riêng biệt của
MrNV, XSV trong eppendorf cĩ bổ sung hạt Bead ở điều kiện 520C trong 30 phút. Thành phần hai Mix sử dụng cho phản ứng Single - Step RT - PCR trên RNA của MrNV, XSV:
Bảng 3.3: Thành phần hai Mix của phản ứng Single - Step RT - PCR
Hai virus Thành phần của hai Mix Tổng Thể tích ( 50 l )
MrNV H20 – DEPC 43 l MrNV -RNA2-F (20 pmol/ l) 1 l MrNV-RNA2-R (20 pmol/ l) 1 l Bản mẫu 5 l XSV H20 – DEPC 43 l XSV - F (20 pmol/ l) 1 l XSV - R (20 pmol/ l) 1 l
Bản mẫu 5 l
Kết thúc quá trình phiên mã ngƣợc, dung dịch phản ứng đƣợc biến tính ở 940C trong 2 phút nhằm ức chế enzym phiên mã ngƣợc. Sau đĩ thực hiện quá trình khuếch đại acid nucleic bằng phƣơng pháp PCR hai mồi MrNV - RNA2 - F và MrNV - RNA2 - R cho MrNV, XSV - F và XSV - R cho XSV trong 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm:
Giai đoạn biến tính: 940C trong 40s Giai đoạn bắt cặp: 550C trong 40s
Giai đoạn kéo dài mạch: 680C trong 1 phút
Hỗn hợp cuối của phản ứng đƣợc duy trì ở: 680C trong 10 phút Sản phẩm tạo thành cĩ kích thƣớc 681 bp của MrNV và 500 bp của XSV.
3.3.3. PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI ACID NUCLEIC TRÊN GEL AGAROSE
Phƣơng pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của acid nucleic trong dung dịch. Đĩ là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của một điện trƣờng, chúng sẽ di chuyển về cực dƣơng của điện trƣờng. Tính linh động của acid nucleic phụ thuộc phần lớn vào hai chỉ tiêu: kích thƣớc của acid nucleic và nồng độ của chất cấu thành gel. Gel agarose thƣờng rất thơng dụng để phân tách một đoạn cĩ kích thƣớc khoảng 0.5 - 10 Kb. Ở các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhĩm phân tử cĩ kích thƣớc khác nhau. Để đọc kết quả điện di ngƣời ta bổ sung một lƣợng ethium bromide. Ethidium bromide cĩ khả năng gắn xen vào giữa các nucleotide của phân tử DNA. Do đĩ, các phân tử DNA sẽ gắn kết với ethium bromide và phát huỳnh quang khi kích thích bằng tia tử ngoại. Dựa vào vị trí các vết huỳnh quang này ngƣời ta biết đƣợc vị trí các đoạn DNA trên gel.
Trong kỹ thuật điện di DNA, ngƣời ta thƣờng sử dụng các thang chuẩn với mục đích so sánh và ƣớc lƣợng kích thƣớc các phân tử điện di. Các thang chuẩn này là hỗn hợp gồm nhiều đoạn DNA (đối với thang DNA).
Dựa vào kích thƣớc đã biết của các phân tử trên thang chuẩn và dựa vào sự so sánh vị trí của các phân tử trên gel với thang chuẩn để xác định kích thƣớc các phân tử mục tiêu.
Cách tiến hành:
Cân 1g agarose cho vào bình tam giác 250 ml, thêm vừa đủ 100 ml TBE 1X vào, đun nĩng cho tan agarose. Để nguội khoảng 50 - 550C, cho vào 2 l ethidium bromide (10 mg/ml). Trong thời gian chờ nguội ta lắp lƣợc vào khay, đổ gel vào khay, đợi 15 - 30 phút cho gel đơng lại. Đổ TBE 1X vào bồn điện di cho ngập (cao hơn gel khoảng 5 mm). Khi gel đã khơ, rút lƣợc ra khỏi giếng, đặt gel vào bồn điện di.
Nạp mẫu:
Cho vào eppendorf (0,2 ml) 10 l mẫu và 2 l dung dịch nạp mẫu (bromophenol blue). Trộn đều, hút khoảng 10 - 12 l mẫu đặt vào giếng. Tƣơng tự đối với DNA chuẩn chạy điện di ở hiệu điện thế 100 V, cƣờng độ dịng điện 2 Ampe, trong thời gian 40 phút.
Phát hiện vạch DNA sản phẩm:
Sau khi chạy điện di, các phân tử DNA (sản phẩm của PCR và của thang chuẩn) đƣợc nhuộm bởi ethidium bromide sẽ tập trung tại nơi cĩ DNA, xen vào giữa hai sợi DNA xoắn kép. Gel đã nhuộm này đƣợc xem dƣới tia tử ngoại. Phức DNA - ethidium bromide hấp thụ tia tử ngoại ở 300 nm, cịn lại một ít năng lƣợng và phát ra ở dạng tia sáng nhìn thấy đƣợc 590 nm. Dƣới tia tử ngoại, các đoạn DNA (sản phẩm của PCR) hiện ra cĩ màu đỏ cam trên gel.
3.4. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
3.4.1. Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện MrNV, XSV từ mẫu tơm bệnh (chứng dƣơng) đƣợc cung cấp từ Ấn Độ.
Trong thử nghiệm này chúng tơi đã sử dụng đúng qui trình của tác giả đƣa ra. Thử nghiệm qui trình trên 1 mẫu tơm thịt đã xác định nhiễm MrNV và XSV cung cấp từ Ấn Độ, 1 mẫu tơm khơng bị bệnh đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp mơ học, và 1 mẫu chứng âm (RNA bản mẫu đƣợc thay bằng H20 - DEPC). Các mẫu đƣợc tách chiết theo bộ Kit.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.
3.4.2. Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT - PCR
3.4.2.1. So sánh hai qui trình tách chiết RNA bằng Trizol (Peter Walker) và AquaPure RNA Isolation Kit (Bio Rad). và AquaPure RNA Isolation Kit (Bio Rad).
Tách chiết RNA từ mẫu chứng dƣơng bằng hai phƣơng pháp Trizol và bộ Kit, chúng tơi thực hiện phản ứng RT - PCR cho cả hai virus MrNV, XSV.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.
3.4.2.2. Khảo sát nồng độ mồi
Theo qui trình của Widada, Sahul Hameed và cộng sự, nồng độ mồi sử dụng cho phản ứng là 20 mol. Tiến hành khảo sát với dãy nồng độ mồi cho cả hai virus nhƣ sau : 10 mol, 15 mol, 20 mol, 25 mol, 30 mol. Thử nghiệm đƣợc thực hiện trên mẫu chứng dƣơng.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.
3.4.2.3. Khảo sát nhiệt độ lai của mồi
Theo qui trình gốc nhiệt độ lai của mồi là 550C. Tiến hành phản ứng với dãy nhiệt độ từ 54 - 580C cho cả hai virus theo bảng sau:
Bảng 3.4: Bảng khảo sát nhiệt độ lai của các mồi
Thí Nghiệm 1 2 3 4 5
Tm (MrNV) 540C 550C 560C 570C 580C Tm (XSV) 540C 550C 560C 570C 580C
Các thành phần trong mỗi phản ứng thí nghiệm là nhƣ nhau đối với RNA bản mẫu tách chiết từ mẫu chứng dƣơng đƣợc cung cấp tại Ấn Độ.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
3.4.3. Ứng dụng qui trình Single - Step RT - PCR khảo sát đƣợc kiểm tra một số mẫu tơm càng xanh thu thực địa.
Áp dụng thử nghiệm qui trình khảo sát đƣợc trên 50 mẫu tơm càng xanh ở các giai đoạn khác nhau, số lƣợng mẫu đƣợc thử nghiệm theo bảng sau:
Bảng 3.5: Các loại mẫu tơm càng xanh thu ở các giai đoạn khác nhau
Giai đoạn Số lƣợng (mẫu) Địa điểm thu
Ấu trùng 30 Trại Thực Nghiệm TĐ
Tơm mẹ 10 Trại Thực Nghiệm TĐ
Tơm mẹ 8 ĐBSCL
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ MẪU TƠM BỆNH ĐUƠI TRẮNG ĐƢỢC CUNG CẤP TỪ ẤN ĐỘ
Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện hai lồi virus MrNV, XSV trên mẫu tơm thịt đƣợc cung cấp từ Ấn Độ. Chúng tơi tiến hành thực hiện đồng thời mẫu chứng âm (đầy đủ các thành phần trừ RNA bản mẫu) và 1 mẫu tơm bình thƣờng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp mơ học, để xác định mức độ đặc hiệu của mồi và kiểm tra mức độ ngoại nhiễm khi tiến hành trong phịng thí nghiệm của Viện Nghiên Cứu Nuơi Trồng Thủy Sản II.
Sau 3 lần lặp lại thí nghiệm, kết quả tƣơng đối giống nhau cho mẫu chứng dƣơng, khơng cĩ sự thay đổi. Hình 4.1 là hình đại diện cho lần lặp lại thứ 3.
Hình 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại từ mẫu tơm càng xanh
nhiễm MrNV, XSV. Giếng 1: mẫu chứng âm.
Giếng 2: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm bình thƣờng khơng nhiễm XSV. Giếng 3: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm nhiễm XSV.
MrNV
XSV 500 bp 681 bp
Giếng 4: sản phẩm từ RT - PCR từ mẫu tơm bệnh nhiễm MrNV. Giếng 5: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm bình thƣờng khơng nhiễm MrNV. Giếng 6: mẫu chứng âm.
Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III.
Mẫu tơm thịt bệnh đƣợc cung cấp từ Ấn Độ đƣợc tách chiết bằng bộ Kit cĩ 1 vạch sản phẩm cĩ kích thƣớc 500 bp là XSV (giếng 3) và 1 vạch sản phẩm cĩ kích thƣớc 681 bp là MrNV (giếng 4), các kết quả này đúng với Widada, Sahul Hameed và cộng sự.
Để kiểm tra tính đặc hiệu của mồi chúng tơi thực hiện một mẫu tơm bình thƣờng. RNA của tơm khơng nhiễm MrNV, XSV (giếng 2, 5). Ở các giếng (2, 5)
khơng thấy cĩ sản phẩm khuếch đại chứng tỏ mồi sử dụng trong phản ứng Single - Step RT - PCR rất đặc hiệu.
Để kiểm tra vấn đề ngoại nhiễm chúng tơi tiến hành làm hai mẫu chứng âm (giếng 1, 6), mẫu này cĩ đầy đủ các thành phần của phản ứng chỉ trừ RNA bản mẫu. Mẫu này khơng cho sản phẩm khuếch đại nào chứng tỏ phản ứng Single - Step RT - PCR mà chúng tơi thực hiện khơng bị ngoại nhiễm.
Kết luận: từ kết quả hình 4.1 cho thấy qui trình mà chúng tơi ứng dụng cho kết quả tốt phù hợp với những nghiên cứu từ trƣớc.
4.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN CỦA QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR SINGLE - STEP RT - PCR
4.2.1. Kết quả so sánh hai qui trình tách chiết
Trong phản ứng RT - PCR cơng đoạn tách chiết RNA đƣợc xem là một trong những bƣớc quyết định. Do đĩ chúng tơi tiến hành hai phƣơng pháp tách chiết khác nhau trên 1 mẫu tơm thịt bệnh trắng đuơi đƣợc cung cấp từ Ấn Độ theo bộ Kit và theo phƣơng pháp Trizol để cĩ thể đánh giá đƣợc hiệu quả của hai phƣơng pháp tách chiết này.
Hình 4.2: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại RT-PCR từ mẫu chứng dƣơng đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol.
Phần A, C: sản phẩm khuếch đại RNA tách chiết bằng bộ Kit. Phần B, D: sản phẩm khuếch đại RNA tách chiết bằng Trizol.
Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm nhiễm MrNV. Giếng 8, 9, 10, 11, 12, 13: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm nhiễm XSV. Giếng 7, 14: mẫu chứng âm.
Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III.
Bảng 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol Tách chiết Virus Lần 1 Lần 2 Lần 3 Kết quả
Bộ Kit MrNV giếng 1 giếng 2 giếng 3 ++++ XSV giếng 8 giếng 9 giếng 10 ++
Trizol
MrNV giếng 4 giếng 5 giếng 6 +++ XSV giếng 11 giếng 12 giếng 13 +
(+): biểu hiện mức độ sáng của sản phẩm.
Qua 3 lần thử nghiệm trên mẫu chứng dƣơng, chúng tơi nhận thấy vạch sản phẩm từ RNA tách chiết bằng bộ Kit cĩ độ sáng đậm hơn vạch sản phẩm của RNA tách chiết theo phƣơng pháp Trizol.
Nhìn chung cả hai qui trình tách chiết đều đạt yêu cầu. Tuy nhiên mỗi phƣơng pháp cĩ ƣu và nhƣợc điểm riêng:
MrNV
1 2 3 M 4 5 6 7
XSV
8 9 10 M 11 12 13 14
Phƣơng pháp Trizol là phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số phƣơng pháp này đơn giản ít tốn thời gian, hố chất cĩ thể tƣ pha. Lƣợng RNA thu đƣợc dễ bị lẫn phenol và các tạp chất khác trong quá trình tách chiết nếu thao tác khơng cẩn thận, phƣơng pháp Trizol sử dụng phenol và chloroform, hai chất này rất độc đối với ngƣời tách chiết. Hố chất Trizol cĩ thể tự pha nên cĩ thể sai sĩt trong quá trình pha, nhƣ việc hút phenol khơng đúng cách, khơng đủ thể tích, cân khơng đủ lƣợng, dễ nhiễm RNAase, các vi sinh vật. Các yếu tố đĩ ảnh hƣởng lớn đến quá trình tách chiết.
Phƣơng pháp tách chiết theo bộ Kit địi hỏi theo điều kiện tách chiết của bộ Kit, hố chất sử dụng trong bộ Kit tuân theo qui trình sản xuất nghiêm ngặt, khơng nhiễm RNAase, các vi sinh vật nên lƣợng RNA thu đƣợc sẽ rất nhiều và khơng gãy vụn, khơng cĩ sử dụng phenol và chloroform nên khơng độc đối với ngƣời tách chiết. Trong quá trình tách chiết khơng bị lẫn tạp chất nhiều. Tuy nhiên tách chiết phải ủ trên đá trong suốt quá trình tách chiết. Nếu thực hiện trong thời gian dài thì lƣợng đá phải đƣợc bổ sung, cơng việc này làm ngắt quảng quá trình tách chiết và làm mất thời gian.
Nhƣ vậy, qua hai quá trình tách chiết từ mẫu tơm bệnh đƣợc cung cấp từ Ấn Độ. Chúng tơi nhận thấy rằng trong dịch tách chiết của mẫu tơm thịt bị nhiễm bệnh luơn tồn tại hai virus MrNV và XSV.
4.2.2. Kết quả khảo sát nồng độ mồi
Tiến hành pha lỗng mồi từ ống gốc cĩ nồng độ là 30 mol theo dãy sau: 10 mol, 15 mol, 20 mol, 25 mol, 30 mol. Sau 3 lần lặp lại thí nghiệm, kết quả tƣơng đối giống nhau, khơng cĩ sự thay đổi đáng kể. Hình 4.3 là hình đại diện cho lần lặp lại thứ 3.
Tiến hành 10 phản ứng Single - Step RT - PCR trên bản mẫu RNA của mẫu chứng dƣơng ở các nồng độ pha lỗng khác nhau với kết quả nhƣ sau:
Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR từ mẫu chứng dƣơng ở các nồng độ mồi khác nhau
Hình A: dãy khảo sát nồng độ của MrNV. Hình B: dãy khảo sát nồng độ của XSV. (-): mẫu chứng âm.
Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III.
Ở Hình A, chúng tơi nhận thấy ở nồng độ 20 mol vạch sản phẩm cĩ độ sáng rõ và khá đậm và gần tƣơng đồng với nồng độ 25 mol, ở nồng độ 30 mol các vạch sản phẩm này cĩ hiện tƣợng smear khá nhiều chứng tỏ lƣợng mồi thừa cho nên để tiết kiệm mồi mà cĩ thể phát hiện đƣợc MrNV nên chúng tơi chọn ở nồng độ 20 mol.
Ở Hình B, nồng độ 20 mol cĩ vạch sản phẩm gần bằng nồng 25 mol nhƣng yếu hơn 30 mol. Vậy để tiết kiệm lƣợng mồi mà vẫn cĩ thể phát hiện đƣợc XSV nên chúng tơi chọn nồng độ 20 mol.
4.2.3. Kết quả khảo sát nhiệt lai của mồi
Trƣớc khi tiến hành khảo sát hai dãy nhiệt độ của MrNV, XSV chúng tơi
lựa chọn ra mẫu chứng dƣơng đã tách chiết theo bộ Kit để khảo sát. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
10 15 20 25 30 M 9 10 10 15 20 25 30 M 11 12