3.4.1. Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện MrNV, XSV từ mẫu tơm bệnh (chứng dƣơng) đƣợc cung cấp từ Ấn Độ.
Trong thử nghiệm này chúng tơi đã sử dụng đúng qui trình của tác giả đƣa ra. Thử nghiệm qui trình trên 1 mẫu tơm thịt đã xác định nhiễm MrNV và XSV cung cấp từ Ấn Độ, 1 mẫu tơm khơng bị bệnh đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp mơ học, và 1 mẫu chứng âm (RNA bản mẫu đƣợc thay bằng H20 - DEPC). Các mẫu đƣợc tách chiết theo bộ Kit.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.
3.4.2. Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT - PCR
3.4.2.1. So sánh hai qui trình tách chiết RNA bằng Trizol (Peter Walker) và AquaPure RNA Isolation Kit (Bio Rad). và AquaPure RNA Isolation Kit (Bio Rad).
Tách chiết RNA từ mẫu chứng dƣơng bằng hai phƣơng pháp Trizol và bộ Kit, chúng tơi thực hiện phản ứng RT - PCR cho cả hai virus MrNV, XSV.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.
3.4.2.2. Khảo sát nồng độ mồi
Theo qui trình của Widada, Sahul Hameed và cộng sự, nồng độ mồi sử dụng cho phản ứng là 20 mol. Tiến hành khảo sát với dãy nồng độ mồi cho cả hai virus nhƣ sau : 10 mol, 15 mol, 20 mol, 25 mol, 30 mol. Thử nghiệm đƣợc thực hiện trên mẫu chứng dƣơng.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.
3.4.2.3. Khảo sát nhiệt độ lai của mồi
Theo qui trình gốc nhiệt độ lai của mồi là 550C. Tiến hành phản ứng với dãy nhiệt độ từ 54 - 580C cho cả hai virus theo bảng sau:
Bảng 3.4: Bảng khảo sát nhiệt độ lai của các mồi
Thí Nghiệm 1 2 3 4 5
Tm (MrNV) 540C 550C 560C 570C 580C Tm (XSV) 540C 550C 560C 570C 580C
Các thành phần trong mỗi phản ứng thí nghiệm là nhƣ nhau đối với RNA bản mẫu tách chiết từ mẫu chứng dƣơng đƣợc cung cấp tại Ấn Độ.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
3.4.3. Ứng dụng qui trình Single - Step RT - PCR khảo sát đƣợc kiểm tra một số mẫu tơm càng xanh thu thực địa.
Áp dụng thử nghiệm qui trình khảo sát đƣợc trên 50 mẫu tơm càng xanh ở các giai đoạn khác nhau, số lƣợng mẫu đƣợc thử nghiệm theo bảng sau:
Bảng 3.5: Các loại mẫu tơm càng xanh thu ở các giai đoạn khác nhau
Giai đoạn Số lƣợng (mẫu) Địa điểm thu
Ấu trùng 30 Trại Thực Nghiệm TĐ
Tơm mẹ 10 Trại Thực Nghiệm TĐ
Tơm mẹ 8 ĐBSCL
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ MẪU TƠM BỆNH ĐUƠI TRẮNG ĐƢỢC CUNG CẤP TỪ ẤN ĐỘ
Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện hai lồi virus MrNV, XSV trên mẫu tơm thịt đƣợc cung cấp từ Ấn Độ. Chúng tơi tiến hành thực hiện đồng thời mẫu chứng âm (đầy đủ các thành phần trừ RNA bản mẫu) và 1 mẫu tơm bình thƣờng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp mơ học, để xác định mức độ đặc hiệu của mồi và kiểm tra mức độ ngoại nhiễm khi tiến hành trong phịng thí nghiệm của Viện Nghiên Cứu Nuơi Trồng Thủy Sản II.
Sau 3 lần lặp lại thí nghiệm, kết quả tƣơng đối giống nhau cho mẫu chứng dƣơng, khơng cĩ sự thay đổi. Hình 4.1 là hình đại diện cho lần lặp lại thứ 3.
Hình 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại từ mẫu tơm càng xanh
nhiễm MrNV, XSV. Giếng 1: mẫu chứng âm.
Giếng 2: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm bình thƣờng khơng nhiễm XSV. Giếng 3: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm nhiễm XSV.
MrNV
XSV 500 bp 681 bp
Giếng 4: sản phẩm từ RT - PCR từ mẫu tơm bệnh nhiễm MrNV. Giếng 5: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm bình thƣờng khơng nhiễm MrNV. Giếng 6: mẫu chứng âm.
Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III.
Mẫu tơm thịt bệnh đƣợc cung cấp từ Ấn Độ đƣợc tách chiết bằng bộ Kit cĩ 1 vạch sản phẩm cĩ kích thƣớc 500 bp là XSV (giếng 3) và 1 vạch sản phẩm cĩ kích thƣớc 681 bp là MrNV (giếng 4), các kết quả này đúng với Widada, Sahul Hameed và cộng sự.
Để kiểm tra tính đặc hiệu của mồi chúng tơi thực hiện một mẫu tơm bình thƣờng. RNA của tơm khơng nhiễm MrNV, XSV (giếng 2, 5). Ở các giếng (2, 5)
khơng thấy cĩ sản phẩm khuếch đại chứng tỏ mồi sử dụng trong phản ứng Single - Step RT - PCR rất đặc hiệu.
Để kiểm tra vấn đề ngoại nhiễm chúng tơi tiến hành làm hai mẫu chứng âm (giếng 1, 6), mẫu này cĩ đầy đủ các thành phần của phản ứng chỉ trừ RNA bản mẫu. Mẫu này khơng cho sản phẩm khuếch đại nào chứng tỏ phản ứng Single - Step RT - PCR mà chúng tơi thực hiện khơng bị ngoại nhiễm.
Kết luận: từ kết quả hình 4.1 cho thấy qui trình mà chúng tơi ứng dụng cho kết quả tốt phù hợp với những nghiên cứu từ trƣớc.
4.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN CỦA QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR SINGLE - STEP RT - PCR
4.2.1. Kết quả so sánh hai qui trình tách chiết
Trong phản ứng RT - PCR cơng đoạn tách chiết RNA đƣợc xem là một trong những bƣớc quyết định. Do đĩ chúng tơi tiến hành hai phƣơng pháp tách chiết khác nhau trên 1 mẫu tơm thịt bệnh trắng đuơi đƣợc cung cấp từ Ấn Độ theo bộ Kit và theo phƣơng pháp Trizol để cĩ thể đánh giá đƣợc hiệu quả của hai phƣơng pháp tách chiết này.
Hình 4.2: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại RT-PCR từ mẫu chứng dƣơng đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol.
Phần A, C: sản phẩm khuếch đại RNA tách chiết bằng bộ Kit. Phần B, D: sản phẩm khuếch đại RNA tách chiết bằng Trizol.
Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm nhiễm MrNV. Giếng 8, 9, 10, 11, 12, 13: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm nhiễm XSV. Giếng 7, 14: mẫu chứng âm.
Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III.
Bảng 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol Tách chiết Virus Lần 1 Lần 2 Lần 3 Kết quả
Bộ Kit MrNV giếng 1 giếng 2 giếng 3 ++++ XSV giếng 8 giếng 9 giếng 10 ++
Trizol
MrNV giếng 4 giếng 5 giếng 6 +++ XSV giếng 11 giếng 12 giếng 13 +
(+): biểu hiện mức độ sáng của sản phẩm.
Qua 3 lần thử nghiệm trên mẫu chứng dƣơng, chúng tơi nhận thấy vạch sản phẩm từ RNA tách chiết bằng bộ Kit cĩ độ sáng đậm hơn vạch sản phẩm của RNA tách chiết theo phƣơng pháp Trizol.
Nhìn chung cả hai qui trình tách chiết đều đạt yêu cầu. Tuy nhiên mỗi phƣơng pháp cĩ ƣu và nhƣợc điểm riêng:
MrNV
1 2 3 M 4 5 6 7
XSV
8 9 10 M 11 12 13 14
Phƣơng pháp Trizol là phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số phƣơng pháp này đơn giản ít tốn thời gian, hố chất cĩ thể tƣ pha. Lƣợng RNA thu đƣợc dễ bị lẫn phenol và các tạp chất khác trong quá trình tách chiết nếu thao tác khơng cẩn thận, phƣơng pháp Trizol sử dụng phenol và chloroform, hai chất này rất độc đối với ngƣời tách chiết. Hố chất Trizol cĩ thể tự pha nên cĩ thể sai sĩt trong quá trình pha, nhƣ việc hút phenol khơng đúng cách, khơng đủ thể tích, cân khơng đủ lƣợng, dễ nhiễm RNAase, các vi sinh vật. Các yếu tố đĩ ảnh hƣởng lớn đến quá trình tách chiết.
Phƣơng pháp tách chiết theo bộ Kit địi hỏi theo điều kiện tách chiết của bộ Kit, hố chất sử dụng trong bộ Kit tuân theo qui trình sản xuất nghiêm ngặt, khơng nhiễm RNAase, các vi sinh vật nên lƣợng RNA thu đƣợc sẽ rất nhiều và khơng gãy vụn, khơng cĩ sử dụng phenol và chloroform nên khơng độc đối với ngƣời tách chiết. Trong quá trình tách chiết khơng bị lẫn tạp chất nhiều. Tuy nhiên tách chiết phải ủ trên đá trong suốt quá trình tách chiết. Nếu thực hiện trong thời gian dài thì lƣợng đá phải đƣợc bổ sung, cơng việc này làm ngắt quảng quá trình tách chiết và làm mất thời gian.
Nhƣ vậy, qua hai quá trình tách chiết từ mẫu tơm bệnh đƣợc cung cấp từ Ấn Độ. Chúng tơi nhận thấy rằng trong dịch tách chiết của mẫu tơm thịt bị nhiễm bệnh luơn tồn tại hai virus MrNV và XSV.
4.2.2. Kết quả khảo sát nồng độ mồi
Tiến hành pha lỗng mồi từ ống gốc cĩ nồng độ là 30 mol theo dãy sau: 10 mol, 15 mol, 20 mol, 25 mol, 30 mol. Sau 3 lần lặp lại thí nghiệm, kết quả tƣơng đối giống nhau, khơng cĩ sự thay đổi đáng kể. Hình 4.3 là hình đại diện cho lần lặp lại thứ 3.
Tiến hành 10 phản ứng Single - Step RT - PCR trên bản mẫu RNA của mẫu chứng dƣơng ở các nồng độ pha lỗng khác nhau với kết quả nhƣ sau:
Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR từ mẫu chứng dƣơng ở các nồng độ mồi khác nhau
Hình A: dãy khảo sát nồng độ của MrNV. Hình B: dãy khảo sát nồng độ của XSV. (-): mẫu chứng âm.
Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III.
Ở Hình A, chúng tơi nhận thấy ở nồng độ 20 mol vạch sản phẩm cĩ độ sáng rõ và khá đậm và gần tƣơng đồng với nồng độ 25 mol, ở nồng độ 30 mol các vạch sản phẩm này cĩ hiện tƣợng smear khá nhiều chứng tỏ lƣợng mồi thừa cho nên để tiết kiệm mồi mà cĩ thể phát hiện đƣợc MrNV nên chúng tơi chọn ở nồng độ 20 mol.
Ở Hình B, nồng độ 20 mol cĩ vạch sản phẩm gần bằng nồng 25 mol nhƣng yếu hơn 30 mol. Vậy để tiết kiệm lƣợng mồi mà vẫn cĩ thể phát hiện đƣợc XSV nên chúng tơi chọn nồng độ 20 mol.
4.2.3. Kết quả khảo sát nhiệt lai của mồi
Trƣớc khi tiến hành khảo sát hai dãy nhiệt độ của MrNV, XSV chúng tơi
lựa chọn ra mẫu chứng dƣơng đã tách chiết theo bộ Kit để khảo sát. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
10 15 20 25 30 M 9 10 10 15 20 25 30 M 11 12
Hình 4.4: Kết quả điện di khảo sát nhiệt lai của mồi trên hai virus MrNV, XSV.
Phần A: dãy khảo sát nhiệt độ của XSV. Phần B: dãy khảo sát nhiệt độ của MrNV. (-): mẫu chứng âm.
(+): biểu hiện mức độ sáng của sản phẩm.
Để dễ đánh giá mức độ sáng của sản phẩm, chúng tơi dùng ký hiệu dấu cộng, quan sát từ bản điện di ta thấy tín hiệu sản phẩm tối ƣu của MrNV ở nhiệt độ 550C cĩ độ sáng cao hơn tín hiệu sản phẩm tối ƣu của XSV ở nhiệt độ 550C , nên chúng tơi cho ký hiệu năm dấu cộng để biểu hiện mức độ sáng tối ƣu của MrNV và bốn dấu cộng để biểu hiện mức độ sáng tối ƣu của XSV. Cứ lần lƣợt nhƣ thế, tùy theo mức độ sáng của sản phẩm mà ta ký hiệu dấu cộng nhiều hay ít. Ở đây chúng tơi chỉ dựa vào độ sáng tƣơng đồng để ký hiệu theo bảng trên.
Dựa vào kết quả khảo sát dãy nhiệt độ của MrNV, chúng tơi nhận thấy khơng cĩ
sự thay đổi lớn về tín hiệu sáng của sản phẩm, từ nhiệt độ 540
C -> 580C, ngồi nhiệt độ 550C là tối ƣu nhất, thì thấy ở nhiệt độ 560C là sáng nhất so với các nhiệt độ cịn lại. Ngƣợc lại với dãy nhiệt độ của MrNV thì trong dãy nhiệt độ của XSV cĩ sự thay đổi lớn về tín hiệu sáng của sản phẩm giữa các nhiệt độ, từ 540C -> 580C, ngồi nhiệt độ
Nhiệt độ 540C 550C 560C 570C 580C Tín hiệu sản phẩm (MrNV) ++ +++++ +++ ++ ++ Tín hiệu sản phẩm (XSV) ++ ++++ + + +++ 540 550 560 570 580 M 540 550 560 570 580 XSV MrNV A B
550C là tối ƣu nhất, thì thấy ở nhiệt độ 580C sáng nhất so với các nhiệt độ cịn lại. Từ những nhận xét đĩ, ta thấy từ nhiệt độ tối ƣu 550C chỉ tăng 10C (550C - 560C) trong dãy khảo sát của MrNV thì tín hiệu sản phẩm sáng nhất ở 560C so với các nhiệt độ cịn lại , trong khi dãy nhiệt độ của XSV tăng lên đến 30
C (550C - 580C) thì mới thấy ở 580C là sáng nhất so với các nhiệt độ cịn lại trừ nhiệt độ 550C. Điều đĩ cho thấy hai dãy nhiệt độ của MrNV và XSV tỷ lệ nghịch nhau về tín hiệu sáng của sản phẩm. Điều này rất thuận lợi để phát triển kỹ thuật multiplex.
So sánh hai dãy nhiệt độ của MrNV và XSV ở cặp nhiệt độ 560C, ta thấy cĩ sự tƣơng quan ngƣợc rõ rệt của hai tín hiệu sản phẩm ở nhiệt độ 560C, tín hiệu sản phẩm của MrNV sáng hơn rất nhiều so tín hiệu sản phẩm của XSV. Ngồi trừ cặp nhiệt độ 550C là tối ƣu nhất thì tất cả các cặp nhiệt độ đều khơng cho sản phẩm tối ƣu. Điều này rất thuận lợi để phát triển kỹ thuật multiplex.
Nhƣ vậy, ở nhiệt độ 550C theo qui trình Single - Step RT - PCR là tối ƣu nhất cho hai mồi MrNV và XSV.
4.3. KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR KHẢO SÁT ĐƢỢC PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ NHỮNG MẪU TƠM THU THỰC ĐỊA.
Dựa qui trình đã khảo sát đƣợc, chúng tơi tiến hành khảo sát 50 mẫu tơm càng xanh thu từ Trại Thực nghiệm Thủ Đức và các mẫu tơm mẹ thu tại ĐBSCL.
Chúng tơi tiến hành khảo sát trên 8 mẫu tơm mẹ thu tại ĐBSCL và 1 mẫu tơm postlarvae nghi là bệnh trắng đuơi trƣớc. Kết quả ở hình 4.5.
4.5: Kết quả điện di phát hiện MrNV và XSV trên một số mẫu tơm càng xanh.
Hình A: kết quả điện di phát hiện MrNV. Hình B: Kết quả điện di phát hiện XSV.
Giếng 1, 2 , 4, 6, 7, 8: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm mẹ nhiễm MrNV và XSV. Giếng 9: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm postlarvae nhiễm MrNV và XSV. Giếng 5: âm tính.
Giếng 3: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm mẹ nhiễm MrNV.
Giếng 10: mẫu chứng dƣơng.
Giếng 11: mẫu chứng âm (H20 - DEPC). Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III.
Kết quả thu đƣợc 7 mẫu tơm mẹ dƣơng tính thu ở ĐBSCL và 1 mẫu postlarvae dƣơng tính thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức. Trong đĩ cĩ 5 mẫu bệnh rất nặng nhiễm đồng thời 2 virus MrNV và XSV ở các giếng 1, 2, 4, 7, 9. 2 mẫu bệnh ở mức độ trung bình nhiễm đồng thời MrNV và XSV ở các giếng 6, 8. 1 mẫu bệnh ở mức độ nhẹ nhiễm MrNV ở giếng 3. MrNV XSV 1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10 11 A B 1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10 11
Tiếp tục khảo sát 40 mẫu tơm càng xanh cịn lại. Các mẫu này khơng thấy cĩ biểu hiện của bệnh trắng đuơi.
4.6: Kết quả điện di mẫu tơm mẹ thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức (hình đại diện 10 mẫu).
Giếng :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 âm tính. Giếng 11: mẫu chứng dƣơng.
Giếng 12: mẫu chứng âm (H20 - DEPC). Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III.
Kết quả điện di 40 mẫu đều âm tính tuy nhiên trong 10 mẫu tơm mẹ mà chúng tơi thu khơng cĩ mẫu tơm mẹ sinh ra đàn postlarvae bệnh trắng đuơi, nên chƣa thể xác định cĩ sự lây bệnh từ tơm mẹ cho đàn ấu trùng hay khơng.
Chúng tơi đã tiến hành phản ứng Single - Step PCR trên 50 mẫu tơm càng xanh ở các giai đoạn ấu trùng, tơm postlarvae, tơm mẹ cĩ đƣợc kết quả nhƣ sau:
1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12
MrNV
XSV 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12
Bản g 4.3: Kết quả thực hiện phản ứng RT- PCR trên 50
mẫu tơm càng xanh
(+) : biểu hiện mức độ nhiễm bệnh trắng đuơi
Ký hiệu mẫu Giai đoạn Địa điểm thu Kết quả
MrNV XSV 1 -> 30 Ấu trùng Trại Thực Nghiệm TĐ - -
31 Postlarvae Trại Thực Nghiệm TĐ - - 32 Postlarvae Trại Thực Nghiệm TĐ +++ +++ 33-> 42 Tơm mẹ Trại Thực Nghiệm TĐ - -
43 Tơm mẹ ĐBSCL +++ +++ 44 Tơm mẹ ĐBSCL +++ +++ 45 Tơm mẹ ĐBSCL + - 46 Tơm mẹ ĐBSCL +++ +++ 47 Tơm mẹ ĐBSCL - - 48 Tơm mẹ ĐBSCL ++ + 49 Tơm mẹ ĐBSCL +++ + 50 Tơm mẹ ĐBSCL ++ ++
Tĩm lại trong 50 mẫu mà chúng tơi thực hiện cĩ 7 mẫu tơm nhiễm đồng thời