2.7.1. Khái niệm bức xạ
Bức xạ là sự phát năng lƣợng vào môi trƣờng dƣới dạng tia (tia bức xạ). Bất kỳ bức xạ nào có khả năng ion hóa các nguyên tử hay phân tử mà nó gặp trên đƣờng đi đều coi là tia ion hóa.
Tia ion hóa đƣợc chia làm 2 loại:
Sóng điện từ: tia Roentgen (tia X), tia Gamma (tia γ).
Các hạt cơ bản: α, β, Proton, Neutron …[45]
2.7.2. Bức xạ Gamma
Bức xạ gamma là bức xạ điện từ. Nó đi đƣợc khoảng cách lớn trong không khí và có độ xuyên mạnh. Khi đi vào cơ thể, chúng sẽ tƣơng tác với các chất có trong cơ thể và tạo ra các điện tử thứ cấp. Các điện tử thứ cấp này là các hạt mang điện nên sẽ gây ra hiện tƣợng ion hoá dẫn đến việc phá hủy các tế bào sống trong cơ thể. Xác suất tạo ra các điện tử thứ cấp tỉ lệ với năng lƣợng của bức xạ gamma theo hàm mũ [46; 47]
2.7.3. Chất phóng xạ Coban (cobalt)
Coban (Co60) có nhiều ứng dụng trong công nghiệp và y học. Đây là kim loại phóng xạ dùng trong xạ trị. Kim loại này có đặc tính tạo ra bụi mịn. Nguồn Co60 hữu dụng trong vòng khoảng 5 năm, nhƣng ngay cả sau thời điểm này, mức độ phóng xạ vẫn rất cao.
Nhiều sinh vật sống (kể cả ngƣời) phải cần đến một lƣợng nhỏ coban trong cơ thể để tồn tại. Coban là một thành phần trung tâm của vitamin cobalamin, hoặc vitamin B12.
Tên gọi Coban (cobalt) có xuất xứ từ tiếng Đức kobalt hoặc kobold, nghĩa là linh hồn của quỷ dữ. Tên này do những ngƣời thợ mỏ đặt ra vì nó mang tính độc hại, gây ô nhiễm môi trƣờng [46].
2.7.4. Cơ chế tác động của bức xạ ion hóa trên cơ thể sống
Bức xạ là một trong những tác nhân gây ra sự tổn thƣơng bức xạ ở mức phân tử, tế bào và hệ thống cơ quan của cơ thể sinh vật.
Các nguyên tử bị ion hóa sẽ làm cho các phân tử cấu tạo nên cơ thể sinh vật có những biến đổi về hóa học. Khi bị tác động thì gene bị biến đổi. Tùy theo mức độ tác động của bức xạ mà gene bị thay đổi ở những mức độ khác nhau.
Sau khi nhận năng lƣợng của bức xạ ion hóa thì các tổ chức tế bào của cơ thể sinh vật sẽ chịu những biến đổi qua hai giai đoạn:
Giai đoạn hóa lý
Giai đoạn này rất ngắn (10-13
- 10-16 giây), trong giai đoạn này các phân tử sinh học chịu tác dụng gián tiếp và trực tiếp của bức xạ ion hóa.
- Tác dụng trực tiếp: bức xạ trực tiếp gây ion hóa và kích thích các phân tử trong tế bào làm tổn thƣơng các phân tử đó, đứt gãy liên kết trong các gene, các nhiễm sắc thể, làm sai lệch cấu trúc và tổn thƣơng đến chức năng của tế bào.
- Tác dụng gián tiếp: khi phân tử nƣớc trong cơ thể bị ion hóa sẽ tạo ra các gốc tự do, các gốc này có hoạt tính hóa học mạnh sẽ hủy hoại các thành phần hữu cơ nhƣ các enzyme, protein, lipit trong tế bào và phân tử DNA, làm tê liệt các chức năng của các tế bào lành khác. Khi số tế bào bị hại, bị chết vƣợt quá khả năng phục hồi của mô hay cơ quan thì chức năng của mô hay cơ quan sẽ bị rối loạn hoặc tê liệt, gây ảnh hƣởng đến cơ thể sinh vật [45].
Trong giai đoạn hóa lý một số phân tử sinh học quan trọng nhƣ enzyme, nucleoprotein đã bị tổn thƣơng, ngƣời ta gọi đó là những tổn thƣơng hóa sinh
Giai đoạn sinh học
Nếu những tổn thƣơng hóa sinh không phục hồi đƣợc, những tổn thƣơng chuyển hóa dẫn đến những tổn thƣơng hình thái và chức năng. Đó là giai đoạn sinh học của tác dụng bức xạ ion hóa. Giai đoạn sinh học có thể kéo dài từ vài ngày đến hàng chục năm sau khi chiếu xạ.
2.7.5. Cơ chế gây đột biến của bức xạ ion hóa
Theo các kết quả nghiên cứu của Rapport (1961), Feitz (1964) và Heis (1965) thì khi tia phóng xạ vào cơ thể sinh vật sẽ tác động vào nhân tố di truyền trong tế bào theo các dạng sau:
Tác động lên nhiễm sắc thể, gây ra hiện tƣợng đột biến nhiễm sắc thể.
Tác động lên các nguyên tử của phân tử DNA, làm biến đổi cấu tạo gene, khi gene tự tái sinh tạo nên gene đột biến và hình thành nên những tính trạng mới.
Sự tác động của tia phóng xạ lên nhân tố di truyền theo các cơ chế sau:
Tác động lên phân tử DNA nghỉ, ngoài thời kì nhân đôi - Làm biến tính base trên DNA nhƣng không phá hủy DNA.
- Làm tách base khỏi khung ribose phosphate của DNA gây đứt chuỗi polynucleotide.
- Tạo các cầu nối đồng hóa trị giữa các base tƣơng xứng từ hai mạch của DNA, làm đứt đoạn DNA và gây ngắn chuỗi DNA.
Tác động lên phân tử DNA đang trong thời kì nhân đôi -Tạo các chất tƣơng tự base của DNA.
-Tạo các chất gây ngừng nhân đôi DNA hoặc gây loại trừ các base.
-Gây sự giao động tại chỗ do chuyển động nhiệt của các nguyên tử trong các base của DNA, gây rối loạn các phản ứng sinh lý, sinh hóa…
Tác động lên hệ thống tổng hợp và sửa chữa DNA
-Làm rối loạn chuỗi phản ứng sinh tổng hợp các base DNA, enzyme… -Làm biến đổi enzyme DNA polymerase
Ảnh hƣởng phối hợp
Tác nhân gây ảnh hƣởng lên hệ thống sửa chữa DNA, làm tăng dần số đột biến tự nhiên. Bức xạ ion hóa gây tác động tổng hợp tạo các mảnh đứt DNA hoặc tạo sự khâu mạch giữa hai chuỗi polynucleotide gần nhau và đối với vài trƣờng hợp có thể gây sắp xếp lại trật tự trên nhiễm sắc thể.
2.7.6. Những thành tựu nghiên cứu về đột biến phóng xạ
Ngoài nước
Phƣơng pháp gây đột biến gene bằng tia phóng xạ đã đƣợc nghiên cứu từ lâu. Năm 1925, Muller đã tiến hành thành công những công trình nghiên cứu thực nghiệm bằng tia X trên thực vật và trên vi khuẩn và đã tìm ra đƣợc những sinh vật biến dị nổi bật. Vì vậy năm 1925 đƣợc xem là năm ra đời ngành di truyền học phóng xạ.
Ở Mỹ, Humphrey (1951), Rauling (1958), William (1960) và ở Đức, Jashchariss (1956) sau khi nghiên cứu xử lý tia phóng xạ trên cây trồng đều đi đến kết luận: "Tia phóng xạ đã làm thay đổi các đặc điểm sinh trƣởng, phát dục, hình thái tế bào, vật chất di truyền, đồng thời làm xuất hiện những biến dị có hại, có lợi hoặc trung tính trên nhiều loại cây trồng". Đa số các thí nghiệm đã chọn và thu các biến dị có lợi nhƣ: rút ngắn thời gian sinh trƣởng, tăng năng suất, tăng tính kháng sâu bệnh, ít đổ ngã, thấp cây, phân cành nhiều, tăng số lƣợng hoa, đổi màu hoa, tăng trọng lƣợng hoa.
Năm 1964, tổ chức phối hợp FAO/IAEA (Cơ quan lƣơng nông liên hiệp quốc/ Cơ quan nguyên tử năng quốc tế) đƣợc thành lập và tổ chức này đã công bố 1019
giống đột biến ở những cây có hạt đƣợc đƣa vào sản xuất và 523 giống đột biến ở những cây sinh sản vô tính và các cây làm cảnh khác nhau. Nhiều loại cây trồng quan trọng có số đột biến lớn nhƣ: Đại mạch, Lúa, Lúa mì mềm, Đậu phộng, Đậu nành, Lúa mì cứng, Đậu Hà Lan, Bông vải, Kiều mạch và rất nhiều giống hoa khác nhau.
Năm 2002, nhóm khoa học của Jammala Machaiah và Mrinal Pednekar, tại Trung tâm Nguyên tử Bhabha (Ấn Độ), đã dùng tia gamma yếu khử gần hết các thành tố axit oligosacharide dƣới vỏ đậu Hà Lan và còn rất nhiều nghiên cứu trên thế giới về ảnh hƣởng của tia gamma trên thực vật.
Trong nước
Tại Việt Nam từ năm 1965 – 1970 các nghiên cứu chọn giống đột biến cây trồng đƣợc bắt đầu thực hiện ở Đại học Tổng Hợp Hà Nội. Sau đó, các cơ sở nghiên cứu khác nhƣ: Viện khoa học Việt Nam, Viện khoa học nông nghiệp, Viện di truyền học, Viện cây lƣơng thực và thực phẩm, các trƣờng Đại học nông nghiệp… tiến hành thí nghiệm với tia gamma trên những đối tƣợng cây trồng khác nhau.
Năm 1968, Đại học nông nghiệp I (Hà Nội) đã xử lý phóng xạ Co60
trên đậu nành, thu đƣợc một số dòng có triển vọng nhƣ: M103, A75, A9 có năng suất cao.
Năm 1977, Đại học nông nghiệp IV xử lý tia γ (Co60) trên giống đậu nành Santamaria tạo đƣợc hai giống: A1, A5 có năng suất cao, rút ngắn thời gian sinh trƣởng.
Gần đây, Việt Nam có nhiều nghiên cứu đáng chú ý về ảnh hƣởng của tia gamma lên cây trồng nhƣ:
Nguyễn Văn Vinh (Viện Khoa Học Kỹ Thuật Hạt Nhân), 2002, nghiên cứu chiếu xạ gây đột biến hom mía.
Hoàng Hƣng Tiến (Trung Tâm Kỹ Thuật Hạt Nhân), 2003, nghiên cứu phóng xạ kích thích hạt giống sắn mì.
Nguyễn Tiến Thịnh (Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt), 2004, nghiên cứu chiếu xạ gamma liều thấp lên mẫu khoai tây giống.
Ở Viện Khoa Học Miền Nam, 2004, nghiên cứu gây đột biến giống Lan bằng tia gamma.
Nguyễn Thị Lang và Lê Xuân Thám, 2004, nghiên cứu chiếu xạ gây đột biến giống lúa khô.
Một số nghiên cứu về chiếu xạ kích thích hạt giống hoa Kiết Tƣờng; ảnh hƣởng tia phóng xạ γ trên hoa Lily. Trần Thanh Hân, 2005, Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo cây khoai tây và ảnh hƣởng kích thích sinh trƣởng của bức xạ gamma liều thấp.
Lê Văn Hòa (Khoa Nông nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng ), 2006, nghiên cứu: "Xác đi ̣nh khả năng gây đô ̣t biến giống hoa lan cắt cành (dendrobium sp.) bằng colchicine và tia gamma"
Hiện nay, các đề tài khoa học nghiên cứu về ảnh hƣởng của tia gamma đến kiểu hình, khả năng kích thích sinh trƣởng trên đậu nành, lúa, bắp và những cây trồng khác đang tiếp tục đƣợc nghiên cứu. Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu thử nghiệm áp dụng phƣơng pháp chiếu xạ tạo đột biến đa dạng trên hệ nuôi cấy in vitro nhiều cây trồng
nhƣ khoai lang, khoai tây, dâu tằm, chuối, hoa cẩm chƣớng, hoa hồng, địa lan, cúc... Tuy nhiên kết quả thu đƣợc còn hạn chế (theo tài liệu của Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt năm 2002 – 2006).
Nội dung 2: Khảo sát sự tạo củ in vitro của cây Gloxinia
2.8. Sơ lƣợc về sự tạo củ 2.8.1. Khái niệm về củ
Các sản phẩm đồng hóa đƣợc sinh ra trong quá trình quang hợp, một phần giúp thực vật phát triển bằng cách tham gia vào cấu trúc, một phần đƣợc tích lũy trong các cơ quan dự trữ nhƣ trái, hột, thân, rễ. Đối với những thực vật có khả năng tạo củ thì các chất đồng hóa sẽ đƣợc tích lũy dƣới dạng củ.
Vai trò của củ
Là cơ quan dự trữ carbon, nitrogen ở dạng có thể cung cấp cho các cơ quan khác khi cần thiết.
Là cơ quan nhân giống.
Thực vật có các cơ quan dự trữ thƣờng là những cây lƣu niên.
2.8.2. Sự hình thành củ
Sự hình thành củ có liên quan đến các quá trình trong sự sinh trƣởng của thực vật. Những yếu tố giúp kích thích tăng trƣởng cây thì có tác dụng ức chế quá trình tạo củ, còn các yếu tố ức chế sự tăng trƣởng của cây lại có thể có tác dụng kích thích hình thành củ ở những loài cây tạo củ (Vũ Văn Vụ, 2003) [5]. Vì vậy sự tạo củ của cây chịu
ảnh hƣởng bởi nhiều nhân tố: chế độ dinh dƣỡng, điều kiện môi trƣờng, sự phân chia các chất đồng hóa, kiểu gene…
Quá trình hình thành củ bắt đầu vào cuối giai đoạn tăng trƣởng, khi các cơ quan dinh dƣỡng bắt đầu ngừng sinh trƣởng. Sau đó, sự phình to của củ xảy ra vào giai đoạn phát triển và sinh sản. Khi các cơ quan dinh dƣỡng ngừng sinh trƣởng hẳn, cơ quan sinh sản và dự trữ sẽ hoạt động mạnh. Do đó, nếu ức chế sự sinh trƣởng của các cơ quan sinh dƣỡng (rễ, lá) sẽ thúc đẩy quá trình hình thành củ hay các cơ quan dự trữ khác (Vũ Văn Vụ, 2003) [5].
2.8.3. Phân loại củ
Hiện nay, từ "củ" đƣợc mọi ngƣời dùng để gọi các cơ quan phình ra nằm dƣới mặt đất của thực vật.
Củ là cơ quan dự trữ nằm dƣới mặt đất của thực vật có nhiều nguồn gốc phát sinh khác nhau. Mỗi loại củ đƣợc gọi tên theo quá trình phân hóa của thực vật. Chúng là cơ quan sống tiềm sinh và có khả năng sinh sản vô tính. Các cơ quan dự trữ nằm dƣới đất: hành (true bulb), thân hành (corm), thân củ (tuber), căn hành (rhizome), rễ củ (tuberous root), giả hành (pseudobulb hay false bulb) và một dạng phình to của trục hạ diệp nằm dƣới mặt đất (enlarged hypocotyls) [41; 42; 43; 44].
2.8.4. Các chất dự trữ trong củ
Củ thƣờng chứa nhiều tinh bột, 1 – 2 % trọng lƣợng khô protein. Nguồn protein này đóng vai trò to lớn trong quá trình tích trữ nitrogen, sulfur và carbon giúp thực vật có khả năng tái sinh thành cây mới. Ở củ có rất ít lipid, khoáng và vitamin (Nguyễn Du Sanh, 1998) [4].
2.8.5. Ảnh hƣởng của các yếu tố lên quá trình tạo củ
Chỉ có những loài có khả năng tạo củ mới tạo củ đƣợc và có rất nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo củ. Ngoài các yếu tố môi trƣờng thì kiểu gene, tuổi sinh lý và tình trạng của cây cũng gây ra sự khác nhau đáng kể (Stephen, 1999).
Yếu tố môi trường
A. Cƣờng độ ánh sáng
Thông thƣờng, cƣờng độ ánh sáng cao sẽ giúp cây quang hợp mạnh, tạo nên nhiều sản phẩm biến dƣỡng di chuyển về các cơ quan dự trữ của cây (Nguyễn Du Sanh, 1998) [4]. Tuy nhiên, mỗi loài thực vật đều có ngƣỡng ánh sáng riêng, nếu vƣợt quá ngƣỡng này, không những cây không phát triển mà có khả năng quá trình quang
hợp bị ức chế, vì vậy mà khả năng sinh củ giảm (Bùi Trang Việt, 2000; Nguyễn Du Sanh, 1998) [6], [4]. Khi củ bị phơi trực tiếp ngoài ánh sáng, một số loài cây tạo củ cũng ngừng quá trình tăng trƣởng củ do tinh bột dự trữ trong phần nhu mô giảm, số lƣợng tế bào hóa mộc gia tăng (Nguyễn Du Sanh, 1998) [4].
B. Quang kì
Những nghiên cứu đầu tiên trong sự tạo củ đã chứng minh rằng sự hình thành củ đƣợc kích thích bởi điều kiện ngày ngắn. Thời gian chiếu sáng dài có thể gây ức chế sự hình thành, phát triển của củ, các tia củ dƣới mặt đất vì không phình to thành củ đƣợc nên sinh trƣởng tiếp tục hình thành chồi đâm lên trên mặt đất (gọi là sự sinh trƣởng lần thứ 2), (Vũ Văn Vụ, 2003) [5].
C. Nhiệt độ
Nhiệt độ thấp đƣợc xem là yếu tố điều khiển sự tạo củ trong điều kiện quang kì ngày ngắn. Nhiệt độ lý tƣởng cho sự tạo củ là 15 – 18oC . Nhiệt độ về đêm rất quan trọng đối với việc hình thành củ vì có ảnh hƣởng sự tích lũy carbohydrate (Nguyễn Du Sanh, 1998) [4].
D. Độ ẩm
Đối với thực vật tạo củ, nƣớc rất cần cho quá trình hình thành củ. Trong điều kiện nƣớc bị hạn chế thì tƣợng tầng hoạt động kém, khả năng phân chia của tƣợng tầng giảm. Khi thiếu nƣớc, quá trình quang hợp của thực vật bị ức chế dẫn đến việc cản trở tổng hợp và tich lũy các chất đồng hóa, hạn chế sự phình to củ. Tuy nhiên, thực vật tạo củ chịu úng kém (trừ các loài sen, súng…). Khi bị úng, chất dự trữ trong củ (chủ yếu là carbohydrate) bị thủy phân nhanh, thu hút các vi sinh vật tấn công gây hại củ (Nguyễn Du Sanh, 1998) [4].
E. Giá thể
Cây tạo củ cần một loại giá thể tơi xốp, thấm nƣớc nhanh, giàu dinh dƣỡng và giữ ẩm tốt. Đất tƣơi xốp giúp tƣợng tầng dễ hoạt động phân chia tế bào tốt hơn đất kết quá chặt. Các loại đất sét, đất pha sét, đất giữ nƣớc làm giảm oxy trong đất. Do đó ngăn cản sự tạo củ (Nguyễn Du Sanh, 1998) [4].
Các loại chất đông môi trƣờng đƣợc sử dụng trong phòng thí nghiệm cũng đƣợc xem là giá thể cho sự phát triển của cây.
Loại agar đƣợc dùng phổ biến hiện nay trong nuôi cấy in vitro là dạng agar
Agar làm đông môi trƣờng bằng các liên kết chéo [45]. Hoạt động của agar là tạo những lỗ hỏng để giữ các phân tử trong môi trƣờng. Tuy nhiên, nếu nhƣ sử dụng agar không tinh sạch thì sẽ làm môi trƣờng bị đục màu do các tạp chất gây nên. Agar có thể