4. Kết quả và thảo luận
4.3 Quá trình PCR
Phản ứng PCR bao gồm nhiều thành phần khác nhau trong một chu trình nhiệt, và các thành phần này đều có ảnh hưởng đến kết quả PCR trong đó nồng độ và độ tinh sạch của DNA khuôn đóng vai trò quan trọng. Sản phẩm tách chiết được chúng tôi hoàn thiện ở quy trình ly trích 2 đã đủ độ tinh sạch cho phản ứng PCR. Nhưng nồng độ của nó cao hơn gấp nhiều lần so với nồng độ cần cho phản ứng PCR ( khoảng 3 – 100 ng/ l). DNA mẫu được pha loãng bằng TE 0,5X hoặc nước cất vô trùng. Thang nồng độ DNA chuẩn được sử dụng để định lượng DNA cho phản ứng PCR.
DNA tổng số
phần tạp
Sau khi hoàn thiện được quy trình phản ứng PCR đáng tin cậy cho mục đích khuếch đại vùng ITS chúng tôi tiến hành những phân tích đồng thời thực hiện phản ứng khuếch đại vùng ITS của dòng nấm Trichoderma làm đối chứng định danh nấm
Phytopthora. Chạy điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% trong 75 V/45 phút/ 250 mA.
Sản phẩm DNA khuếch đại vùng lặp lại ITS có kích thước khoảng 900bp. Trong bốn mẫu nấm phân tích chỉ có ba mẫu cho kết quả band 900bp. Trong cùng điều kiện đó, phản ứng khuếch đại vùng ITS của nấm Trichoderma cho band có kích thước khoảng 650 – 700bp. Kết quả này khá phù hợp với những nghiên cứu định danh nấm
Phytopthora trên vùng ITS (Cooke và Duncan, 1997; Trịnh Thị Phương Vy, 2005). Tuy nhiên, kết quả PCR mẫu DL2 trái với kết quả định danh bằng kỹ thuật quan sát hình thái. Kết quả định danh hình thái của kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy khẳng định mẫu DL2 thuộc giống Phytophthora nhưng kết quả PCR trên vùng ITS cho band có kích thước khoảng 800bp.
Hình 4.3. Thang nồng độ DNA chuẩn
Một số lý do giải thích cho kết quả trên bao gồm:
Sự sai khác về vùng bắt cặp của primer trên gen do ITS là vùng có trình tự lặp lại cho nên primer có thể bắt cặp sai vị trí.
Quá trình tăng sinh, nhân sinh khối đã bị tạp nhiễm một giống nấm khác và sản phẩm thu sinh khối dùng cho phản ứng PCR thuộc giống Phytophthora.
Phản ứng PCR chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nồng độ DNA chạy phản ứng, nhiệt độ bắt cặp, nồng độ đoạn mồi bắt cặp. Do giới hạn của thời gian thực hiện đề tài nên chúng tôi chỉ tiến hành kiểm tra kết quả PCR ở yếu tố nồng độ DNA mẫu trên hai mẫu nấm DL1 và DL2.
Để hạn chế khả năng tạp nhiễm chúng tôi đã tiến hành tăng sinh nhân sinh khối và ly trích lại hai mẫu này. DNA mẫu được pha loãng ở hai nồng độ 30ng và 10ng. phản ứng PCR lặp lại với cùng điều kiện phản ứng trên hai mẫu ở hai nồng độ này. Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho ta thấy rằng, sự phụ thuộc của sản phẩm PCR vào nồng độ DNA mẫu.
900bp
Hình 4.4. Kết qủa phản ứng PCR (1) TBR; (2) SRDN; (3) ladder; (4) DL1 ; (5) DL2; (6) mẫu Trichoderma làm đối chứng
Ở hai mẫu một và hai là sản phẩm PCR của hai mẫu Phytophthora trên địa lan với nồng độ 30ng. Trong khi hai mẫu còn lại là kết quả thu được khi chạy PCR hai mẫu trên với nồng độ 10ng.
Chúng tôi tạm thời không thể giải thích rõ ràng kết quả trên tuy nhiên nó cho ta thấy nồng độ DNA mẫu cũng quyết định kết quả PCR.. Ở nồng độ 30ng mẫu chỉ cho ra sản phẩm là một band DNA duy nhất chứng tỏ mẫu DNA ly trích là mẫu tinh sạch không tạp nhiểm với DNA của bất kì một loài nào khác.
Sản phẩm PCR của hai mẫu Phytophthora trên địa lan ở nồng độ 10ng cho hai band rõ ràng, độ sáng như nhau. Kích thước hai band này chênh lệch nhau khoảng 100bp.
Chúng tôi có thể giải thích kết quả trên như sau: thứ nhất nguyên nhân này có thể là do hai mẫu nấm này đã bị tạp nhiễm trong quá trình pha loãng ở nồng độ 10 ng cho nên sản phẩm PCR ở nồng độ 10 ng cho ra hai band khác; thứ hai do quá trình pha loãng không đáng tin cậy. Sản phẩm pha loãng ở 10 ng có nồng độ cao hơn sản phẩm pha loãng ở 30 ng và kích thước đoạn trình tự này có vùng lập lại cho nên trong điều kiện nhất định cặp mồi ITS4 – ITS5 có thể bắt cặp ở nhiều vị trí khác nhau và cho ra sản phẩm PCR có đến hai hay ba band khác nhau trên cùng một vùng trình tự, các band này có độ sáng như nhau.
900bp
Hình 4.5. Sản phẩm PCR lần thứ hai
(1) và (3) PCR mẫu DL1 ở nồng độ 30ng và 10ng (2) và (4) PCR mẫu DL2 ở nồng độ 30ng và 10ng
Như vậy, kết quả chạy PCR ở trên không thể định danh được hai mẫu
Phytophthora. Để định danh được hai mẫu nấm trên, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR nhằm mục đích giải trình tự chúng một cách chính xác hơn.