3. Vật Liệu và phương pháp
3.1.2 Địa điểm thực hiện
- Quá trình tăng sinh, nhân sinh khối được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bệnh Cây – Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật – Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
- Quá trình chiết tách DNA và phản ứng PCR được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật – Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh – Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu và hóa chất:
Chúng tôi tiến hành tăng sinh nhân sinh khối 2 mẫu nấm Phytophthora phân lập trên sầu riêng Đồng Nai, tiêu Bà Rịa và 2 mẫu nấm Phytophthora trên địa lan Đà Lạt của kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy. Các mẫu nấm này đã được định danh bằng kỹ thuật quan sát hình thái.
3.2.1 Phục hồi và nhân sinh khối
a. Vật liệu và hóa chất Đường Glucose Agar Khoai tây Cồn 70% và Cồn 96% Cà rốt CaCO3 3.2.2 Ly trích DNA a. Vật liệu và dụng cụ: Máy vortex Máy ủ nhiệt độ 600 C Máy li tâm Siqma
Pipetman và đầu tip các loại ( hãng Nichikyo Le) b. Hóa chất: ( Merk)
Lysis buffer( 50 mM Tris HCl; 50mM EDTA; 3% SDS; 1% -mercaptoethanol) pH 8,0.
Nitơ lỏng
Hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25: 24: 1). Isopropanol.
Ethanol 70%.
Dung dịch TE ( 10mM Tris HCl; 1mM EDTA; pH 8,0).
3.2.3 Kỹ thuật điện di
a. Vật liệu và hóa chất
Dung dịch TAE( Tris HCl; Na2EDTA 0,5 M; Glacial acetic acid). Agarose.
Thuốc nhuộm gel Ethidium bromide 1%.
3.2.4 Kỹ thuật PCR
a. Vật liệu
Mẫu nấm ly trích. b. Hóa chất ( Biorad)
dNTPs(dATP; dTTP; dGTP; dCTP), MgCl2, 10X PCR buffer. Taq DNA polymerase( BioRad).
Ethidium bromide; dung dịch đệm TAE 0,5%.
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Tăng sinh và nhân sinh khối
Mẫu nấm đã thu thập trên nhiều mẫu khác nhau được tăng sinh trên môi trường PGA.
Thành phần trong 1lít môi trường tăng sinh PGA ( Potato – Glucose Agar) - Khoai tây 200gram
- Glucose 20gram - Agar 15gram - Nước cất vừa đủ 1000ml
Môi trường PGA được hấp tiệt trùng ở 1210C/ 1 atm / 20 phút, được đổ ra đĩa petri.
Tiến hành cấy các dòng nấm Phytophthora từ các mẫu khác nhau vào các đĩa môi trường PGA. Sau đó, các đĩa môi trường này được ủ ở nhiệt độ 250C – 280C.
Sau khoảng 3 – 4 ngày, khi tản nấm đã hình thành và có đường kính khá lớn ( 4 – 5 mm) ta tiến hành cấy mẫu nấm vào môi trường nhân sinh khối lỏng ( môi trường cà rốt ).
Thành phần có trong 1l môi trường cà rốt - Cà rốt 600gram - CaCO3 15gram - Nước cất vừa đủ 1000ml
Cách thực hiện: Cà rốt gọt vỏ, rửa sạch, bào mỏng xay nhuyễn cùng với 700 ml nước cất; hấp tiệt trùng 1000C / 20 phút. Để nguội lọc qua rây và 4 lớp vải lọc, lấy dịch trong. Thêm 15gram CaCO3 vào dung dịch khuấy đều, sau đó lắng 20 phút. Gạn lấy dịch lỏng, bỏ CaCO3. Chia đều dung dịch vào bình tam giác hay chai nước biển với thể tích khoảng 100 ml/chai. Hấp tiệt trùng 1210C/ 1atm / 20 phút.
Cách cấy nấm sang môi trường nhân sinh khối
- Sử dụng đĩa petri mang các khuẩn lạc nấm có đường kính 4 – 5 mm. - Cắt nhỏ ( băm nhuyễn ) rìa mép tản nấm.
- Cấy mẫu nấm đã được băm nhuyễn sang bình chứa môi trường cà rốt.
Sau khi cấy, những bình nhân sinh khối phải được ủ tối từ 7 đến 10 ngày trong điều kiện nhiệt độ phòng, tĩnh lặng.
Quá trình thu sinh khối: mẫu nấm sau khi nhân sinh khối sẽ được lọc qua vải lọc và làm cho khô kiệt bằng giấy thấm. Bảo quản mẫu ở -700C.
3.3.2 Ly trích DNA
Mẫu nấm trước khi chiết tách DNA phải qua quá trình nghiền mẫu trong Nitơ lỏng và được cho vào các eppendorf.
Qui trình ly trích DNA tổng số: dựa trên qui trình ly trích được của Lee và Taylor (1990) có cải tiến thêm một số bước.
Các hóa chất cần pha để thực hiện qui trình ly trích
- Lysis buffer(50mM Tris-HCl; 50mM EDTA; 3% SDS; 1% -mercaptoethanol). - Hỗn hợp Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1).
- TE(10mM Tris-HCl; 1mM EDTA; pH 8,0). Có hai qui trình ly trích DNA được sử dụng
3.3.2.1 Qui trình 1
- Mỗi eppendorf ly trích chứa khoảng một phần ba eppendorf nấm. - Cho vào mỗi eppendorf 750 l Lysis buffer.
- Ủ ở nhiệt độ 650C trong 1 giờ.
- Cho thêm 500 l hỗn hợp Phenol /Chloroform/ Isoamyl alcohol (25:24:1), lắc nhẹ dung dịch có màu trắng đục.
- Ly tâm 13000 rpm/ 15 phút/ 280C, hút pha trên cho vào một eppendorf mới. - Cho isopropanol vào theo tỉ lệ 2:1, dung dịch xuất hiện kết tủa.
- Ly tâm 13000 rpm/ 5 phút/280C, thu nhận DNA cô đặc có màu trắng đục ở đáy eppendorf.
- Rửa mẫu nhiều lần bằng Ethanol 70%. - Hong khô mẫu.
- Hòa tan mẫu với lượng TE 0,5X hay nước cất hai lần vô trùng.
3.3.2.2 Qui trình 2
- Sử dụng mỗi eppendorf chứa khoãng một phần ba eppendorf mẫu. - Cho vào mỗi eppendorf 750 l Lysis Buffer.
- Ủ ở 650C trong một giờ.
- Cho thêm 500 l hỗn hợp Phenol /Chloroform/ Isoamyl alcohol (25:24:1), lắc nhẹ dung dịch có màu trắng đục.
- Ly tâm 13000 rpm/5 phút/ 280C, hút pha trên cho vào một eppendorf mới. - Cho 2 l RNase vào eppendorf trên, ủ ở 370C trong một giờ.
- Hút khoảng 400 l Chloroform/ Isoamyl alcohol cho vào, lắc nhẹ đều. - Ly tâm 13000 rpm/ 5 phút/ 280C, hút pha trên vào một eppendorf mới. - Thêm Isopropanol theo tỉ lệ 2:1, dung dịch xuất hiện kết tủa.
- Ly tâm 13000 rpm/ 5 phút/ 280C, thu nhận DNA cô đặc có màu trắng đục ở đáy eppendorf.
- Rửa mẫu bằng Ethanol 70%. - Hong khô mẫu.
- Pha loãng mẫu với TE 0,5X hay nước cất hai lần vô trùng. Mẫu ly trích được bảo quản ở 40C.
Thành phần trong bản gel agarose 0,8% - Dung dịch TAE 0,5X 12,5ml - Agarose 0,1gram
Sản phẩm ly trích DNA được chạy điện di trong dung dịch TAE và chạy 100V/ 20 phút/ 250mA. Sau đó, miếng gel được nhuộm Ethidium Bromide trước khi đọc kết quả trên máy Geldoc.
DNA tổng số thu được phải được pha loãng ở nồng độ thích hợp để tiến hành phản ứng PCR. Nồng độ DNA chạy phản ứng PCR nằm trong một khoảng khá rộng từ 3ng đến 100ng tùy thuộc mẫu DNA.
3.3.3 Kỹ thuật PCR
Hóa chất cần pha cho phản ứng PCR.Chủ yếu có 3 loại - Pha dNTPs có nồng độ là 2,5mM.
- Pha loãng hai primer ITS4, ITS5 ra nồng độ 100pmol/ l. - Pha loãng mẫu DNA sau cho lượng DNA < 100ngram/ l. - Nhiệt độ bắt cặp Tm = 2*(A+T) + 4*(G+C).
- Trình tự cặp primer chạy PCR lần lượt là:
ITS4 ( 5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’) ITS5 ( 5’ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’) Bảng 3.1.Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 25 l Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích PCR buffer 10X 1X 2,5 l MgCl2 50mM 1,5mM 0,75 l dNTPs 2,5mM 0,2mM 2 l
Primer ITS4 100pmol/ l 10pmol/ l 0,1 l
Primer ITS5 100pmol/ l 10pmol/ l 0,1 l
Taq DNA polymerase 5UI 0,5UI 0,1 l
Nước cất vừa đủ 25 l Bảng 3.2.Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 50 l Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích PCR buffer 10X 1X 5 l MgCl2 50mM 1,5mM 2 l dNTPs 2,5mM 0,2mM 2 l
Primer ITS4 100pmol/ l 10pmol/ l 2 l
Primer ITS5 100pmol/ l 10pmol/ l 2 l
Taq DNA polymerase 5UI 0,5UI 0,2 l
DNA khuôn mẫu <100ngram 1 l
Nước cất vừa đủ
50 l
Bảng 3.3.Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian
Giai đoạn khởi động Giai đoạn chạy phản ứng (30 chu kỳ) Tách DNA khuôn Bắt cặp Kéo dài Giai đoạn kết thúc 94oC 94oC 56oC 72oC 72oC 3 phút 1 phút 45 giây 1 phút 5 phút Kiểm tra sản phẩm PCR :
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose nồng độ 1% - 1,5%.
Thành phần gel 1% chạy điện di: Dung dịch TAE 0,5X 12,5ml
Điều kiện chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR 50V/40 phút/250mA. Sau đó, ta nhuộm gel và chụp hình nhuộm bằng máy Geldoc.
3.3.4 Kỹ thuật tinh sạch
Kỹ thuật tinh sạch đọc trình tự : có hai kỹ thuật tinh sạch chính
3.3.4.1 Kỹ thuật tinh sạch bằng thao tác tay:
- Lấy eppendorf chứa khoảng 20 l mẫu PCR. - Thêm 180 l TE, trộn đều với mẫu.
- Cho vào 200 l Chloroform/ Isoamyl alcohol, trộn với lương mẫu trên. - Ly tâm 13500 rpm/ 5 phút/ 280C, hút dịch nổi cho vào một eppendorf mới. - Thêm 100 l Ethanol 70%, ủ ở -700C trong 30 phút.
- Ly tâm 13500 rpm/ 5 phút, bỏ phần dịch nổi ở trên. - Rửa lại bằng Ethanol 70% .
- Ly tâm 13500 rpm/ 2 phút. - Làm khô mẫu.
- Hòa tan mẫu với TE 0,5X.
3.3.4.2 Kỹ thuật tinh sạch bằng cột GMX
- Sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel agarose đặc biêt 0,8% ( có thể tan ở nhiệt độ thấp) với thể tích từ 15 l cho đến 20 l. Miếng gel chạy điện di được nhuộm Ethidium bromide trong thời gian ngắn (1-2 phút) và được cắt band trên máy chiếu UV. Sản phẩm cắt cho vào một eppendorf mới.
- Cân lượng gel chứa band PCR.
- Cho vào eppendorf dung dịch capture buffer tỉ lệ 1:2 (10 mg gel ≈ 20 l capture buffer), ủ hỗn hợp trên ở 600C trong 15 phút.
- Ly tâm 3000 rpm/ 30 giây.
- Hút mẫu cho vào cột GFX, để mẫu ổn định trong 1 phút. - Ly tâm 9000 rpm/ 30 giây.
- Thêm dung dịch wash buffer với lượng tương đương capture buffer cho vào. - Ly tâm 9000 rpm/ 30 giây.
- Đặt cột vào eppendorf mới.
- Hút 15 l elution buffer nhỏ vào cột GFX, ủ khoảng 3 phút ở nhiệt độ phòng. - Ly tâm 9500 rpm/ 2 phút, lấy cột GFX ra.
- Giữ mẫu tinh sạch ở 40
C.
Trình tự được giải trực tiếp bằng máy giải trình tự ABI TRISM 3100.
3.3.5. Xử lý kết quả giải trình tự:
Ta sử dụng một số phần mềm như sau:
- Sử dụng phần mềm Chromas145-95 để xử lý trình tự
- Phần mềm BLAST để so sánh trình tự với các loài Phytophthora đã được giải trình tự trên ngân hàng gen.( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
- Phần mềm ClustalX để so sánh độ tương đồng của trình tự và vẽ cây sinh loài bằng phần mềm Treeview.
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Quá trình tăng sinh, nhân sinh khối
Chúng tôi áp dụng qui trình tăng sinh nhân sinh khối nấm Phytophthora của kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy (2005) để nhân sinh khối 4 mẫu nấm trên và rút ra một số nhận xét:
- Tất cả 4 mẫu nấm đều phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng tối.
- Nhiệt độ thích hợp cho sự tăng sinh mẫu nấm trên sầu riêng Đồng Nai và trên tiêu Bà Rịa là nhiệt độ phòng trong khi nhiệt độ thích hợp trên 2 mẫu địa lan là 200C – 220C.
Chúng tôi kí hiệu cho 4 mẫu nấm như sau:
Kí hiệu Cây kí chủ Địa điểm
SRDN Sầu riêng Đồng Nai
TBR Tiêu Bà Rịa-Vũng Tàu
DL1 Địa lan Lâm Đồng
DL2 Địa lan Lâm Đồng.
4.2 Quá trình ly trích
Kỹ thuật chiết tách DNA tổng số được xem là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện. Nhưng qui trình tách chiết DNA là một trong những qui trình khởi đầu cho các kỹ thuật sinh học phân tử quan trọng. Do đó nó đóng vai trò thu nhận sản phẩm DNA cho những phản ứng tiếp theo sau bao gồm kỹ thuật PCR và kỹ thuật giải trình tự. Chúng tôi đã tham khảo qui trình ly trích của Lee và Taylor (1990) sau đó cải tiến thêm một số bước cho phù hợp với mẫu nấm Phytophthora. Trong bước ly trích này chúng tôi áp dụng 2 qui trình ly trích khác nhau đã được đề cập ở trên.
Kết quả điện di 100 V/ 15 phút/ 400 mA sản phẩm trên gel agarose 0,8% chúng tôi thu nhận được ở hai qui trình ly trích có sự khác nhau khá rõ:
DNA tổng số
Hình 4.2. Sản phẩm của qui trình ly trích 2
Qui trình ly trích 1 cho kết quả ly trích chưa đạt được hiệu quả. Chúng tôi không thu được DNA. Phần tạp còn quá nhiều Qui trình ly trích 2 đạt được nhiều hiệu quả hơn. Sản phẩm DNA thu được ở dạng tinh sạch khá cao, loại bỏ được tạp nhiễm.
Khi so sánh kết quả của hai qui trình ly trích này ta thấy qui trình ly trích 2 có thêm một số các hóa chất khác như: RNase và Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1). Vai trò của Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) là hòa tan các protein thừa, chất cặn còn lại sau khi đã loại bỏ chúng bằng hỗn hợp Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1). RNase có vai trò loại bỏ RNA nằm trong lượng DNA thu được. Qui trình ly trích 2 (qui trình ly trích tinh sạch) loại bỏ hầu hết những phần tạp nhiễm nhưng vẫn không ảnh hưởng đến chất lượng DNA. Như vậy, chúng tôi đã chiết tách DNA thành công bằng qui trình ly trích 2.
4.3 Quá trình PCR
Phản ứng PCR bao gồm nhiều thành phần khác nhau trong một chu trình nhiệt, và các thành phần này đều có ảnh hưởng đến kết quả PCR trong đó nồng độ và độ tinh sạch của DNA khuôn đóng vai trò quan trọng. Sản phẩm tách chiết được chúng tôi hoàn thiện ở quy trình ly trích 2 đã đủ độ tinh sạch cho phản ứng PCR. Nhưng nồng độ của nó cao hơn gấp nhiều lần so với nồng độ cần cho phản ứng PCR ( khoảng 3 – 100 ng/ l). DNA mẫu được pha loãng bằng TE 0,5X hoặc nước cất vô trùng. Thang nồng độ DNA chuẩn được sử dụng để định lượng DNA cho phản ứng PCR.
DNA tổng số
phần tạp
Sau khi hoàn thiện được quy trình phản ứng PCR đáng tin cậy cho mục đích khuếch đại vùng ITS chúng tôi tiến hành những phân tích đồng thời thực hiện phản ứng khuếch đại vùng ITS của dòng nấm Trichoderma làm đối chứng định danh nấm
Phytopthora. Chạy điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% trong 75 V/45 phút/ 250 mA.
Sản phẩm DNA khuếch đại vùng lặp lại ITS có kích thước khoảng 900bp. Trong bốn mẫu nấm phân tích chỉ có ba mẫu cho kết quả band 900bp. Trong cùng điều kiện đó, phản ứng khuếch đại vùng ITS của nấm Trichoderma cho band có kích thước khoảng 650 – 700bp. Kết quả này khá phù hợp với những nghiên cứu định danh nấm
Phytopthora trên vùng ITS (Cooke và Duncan, 1997; Trịnh Thị Phương Vy, 2005). Tuy nhiên, kết quả PCR mẫu DL2 trái với kết quả định danh bằng kỹ thuật quan sát hình thái. Kết quả định danh hình thái của kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy khẳng định mẫu DL2 thuộc giống Phytophthora nhưng kết quả PCR trên vùng ITS cho band có kích thước khoảng 800bp.
Hình 4.3. Thang nồng độ DNA chuẩn
Một số lý do giải thích cho kết quả trên bao gồm:
Sự sai khác về vùng bắt cặp của primer trên gen do ITS là vùng có trình tự lặp lại cho nên primer có thể bắt cặp sai vị trí.
Quá trình tăng sinh, nhân sinh khối đã bị tạp nhiễm một giống nấm khác và sản phẩm thu sinh khối dùng cho phản ứng PCR thuộc giống Phytophthora.
Phản ứng PCR chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nồng độ DNA chạy phản ứng, nhiệt độ bắt cặp, nồng độ đoạn mồi bắt cặp. Do giới hạn của thời gian thực hiện đề tài nên chúng tôi chỉ tiến hành kiểm tra kết quả PCR ở yếu tố nồng độ DNA mẫu trên hai mẫu nấm DL1 và DL2.
Để hạn chế khả năng tạp nhiễm chúng tôi đã tiến hành tăng sinh nhân sinh khối và ly trích lại hai mẫu này. DNA mẫu được pha loãng ở hai nồng độ 30ng và 10ng. phản ứng PCR lặp lại với cùng điều kiện phản ứng trên hai mẫu ở hai nồng độ này. Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho ta thấy rằng, sự phụ thuộc của sản phẩm PCR