mạnh nhất
Thu dung dịch ca cao như trên. Tiến hành pha loãng lần lượt dung dịch trên thành 6 nồng độ khác nhau: pha loãng 1 lần, 2 lần. 3 lần. 4 lần. 5 lần. 6 lần. Đem đo độ hấp thụ ánh sáng bằng máy đo quang phổở các bước sóng khác nhau. Bước sóng mà cho giá trị hấp thụ cao nhất được xác định là bước sóng để đo độ hấp thụ của dung dịch ca cao.
3.5.4 Phương pháp hóa sinh
3.5.4.1 Các phương pháp xác định các thành phần chủ yếu của hạt cacao cacao
i. Phương pháp xác định độ tro của hạt cacao
Cân chính xác khoảng 2 – 5 g hạt cacao trong một chén sứ đã biết trọng lượng khô tuyệt đối, cho thêm vào chén sứ 5 giọt HNO3 đậm đặc và 1 – 2 giọt H2O2 30%, cho vào lò nung ở 500 – 550 oC cho đến khi nguyên liệu biến thành tro trắng như tàn thuốc lá. Lấy chén sứ ra và cho ngay vào bình hút ẩm, để nguội và cân chính xác. Tổng lượng tro được tính như sau:
Tổng lượng tro (%) = Trọng lượng tro x 100/ trọng lượng mẫu khô
ii. Tổng hữu cơ
Cấu trúc hữu cơ của sinh vật dễ bị phá huỷ bởi các tác nhân kiềm hay acid mạnh có tính oxy hoá ở nhiệt độ cao. Các chất hữu cơ bị oxy hoá hoàn toàn chuyển thành CO2 và nước bay ra khỏi chén sứ. Vì thế cách tính tổng hữu cơ như sau:
iii. Phương pháp xác định N tổng số của hạt cacao
Tổng hữu cơ (%) = 100 % - Tổng tro hữu cơ (%) N tổng số = N protein + N phi protein
Trước tiên ta phải vô cơ hóa mẫu để biến đổi tất cả các loại đạm nằm dưới dạng nào đều trở thành dạng hợp chất vô cơ là amonium sulfate (NH4)SO4
Vô cơ hóa
Sự vô cớ hóa chất đạm là sự biến đổi tất cả các chất đạm dù dưới dạng nào (hữu cơ, protein, vô cơ) thành hợp chất vô cơ là amonium sulfate (NH4)SO4 bằng cách đun sôi với H2SO4đậm đặc và chất xúc tác
Thực hành :
Cân chính xác 1 g nguyên liệu đã nghiền nhuyễn cho vào một bình cổ cao có dung tích 60 ml đến 100 ml (bình Kieldahl). Thêm vào đó 5 ml H2SO4 đậm đặc và khoảng 0.5 g chất xúc tác. Đun sôi hỗn hợp trong tủ hút khí độc từ 2 đến 3 giờ cho đến khi dung dịch trở thành trong suốt và có màu xanh da trời nhạt. Để nguội và pha loãng thành 100 ml với nước cất.
Chất xúc tác là hỗn hợp K2SO4 và CuSO4 tỷ lệ 9 : 1
Phương pháp Kieldahl
Nguyên tắc : Chất đạm đã được vô cơ hóa nằm dưới dạng amonium sulfate đem cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra amoniac
(NH4)2SO4 + 2NaOH Æ 2NH4OH + Na2SO4
Sau đó lượng amoniac được hơi nước lôi cuốn bằng dụng cụ máy Parnas- Wargner và được dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng thừa H2SO4. Từ đây cho phép ta xác định được lượng amoniac phóng thích ra, có nghĩa xác định được lượng đạm có trong mẫu nguyên liệu.
Tiến hành
Đun sôi bình nước của máy Parnas – Warner. Đặt bình tam giác có chứa 20ml H2SO4 N/100 và vài giọt methyl vào phần đuôi của máy sao cho phần nhọn nhúng chìm vào dung dịch. Hút 10 ml dung dịch vô cơ hóa cho vào máy Parnas – Wargner, thêm vào đó 10 ml NaOH đậm đặc. Tiếp tục đun sôi bình nước và để cho hơi nước lôi cuốn amoniac sang bình tam giác trong 3 phút, hạ bình tam giác xuống và tiếp tục đun thêm 2 phút nữa, tráng vòi của máy bằng một tia nước cất, tất cả đều cho chảy vào bình tam giác đựng H2SO4 N/100. Lấy bình tam giác ra và định phân H2SO4 thừa bằng dung dịch NaOH N/100 cho đến khi dung dịch đổi màu.
Tính toán
Hàm lượng nitơ có trong mẫu được xác định theo công thức
1 2 ( ).1, 42. .100 ( %) V V f N mg w − =
Trong đó
V1: số ml H2SO4. 0,1N cho vào bình hứng
V2: số ml NaOH dùng để chuẩn độ acid dư trong bình hứng
f: hệ số điều chỉnh nồng độ H2SO4 ở bình hứng, f=1 khi nồng độ H2SO4 chính xác 0,1 N
w: khối lượng mẫu dùng để vô cơ hóa mẫu ứng với thể tích dung dịch lấy mẫu để định lượng nitơ tương ứng với 1 ml H2SO4
1,42: số mg nitơ
iv. Phương pháp xác định đường tổng số hòa tan Nguyên tắc
Sự định lượng này căn bản dựa trên phản ứng màu đặc trưng cho bởi đường và nhiều chất hữu cơ với sự hiện diện của H2SO4. Để tạo phản ứng màu có thể dùng thuốc thử khác nhau như phenol, antron hay orcinol
Sự chính xác của kết quả này phụ thuộc: ¾ Độ sạch dụng cụ
¾ Độ tinh khiết của thuốc thử, nhất là H2SO4
¾ Nhiệt độ phải cốđịnh trong suốt thời gian đun
Tiến hành
Nguyên liệu: lấy 1-2 g nguyên liệu tươi đã nghiền nhỏ chứa khoảng 5 – 50 mg
đường
Cho vào cốc thủy tinh 50 ml và thêm 10 ml cồn 90 % V vào.
Đun sôi trên nồi cách thủy 3 lần
Sau khi để nguội lọc qua lọc không tro
Sau đó thêm 10 ml cồn 80 % V vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun hai lần tới sôi trên nồi cách thủy. Để nguội lại tiếp tục lọc. Chiết rút như vậy khoảng 2 lần, xong đưa bã lên lọc và rửa sạch 2 - 3 lần bằng rượu nóng 80o
Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong nồi cách thủy
Cặn khô trong cốc được pha loãng thành 50 ml với nước cất Thực hiện phản ứng màu
Hút 1 ml dung dịch đường cho vào ống nghiệm rồi đổ thêm 1 ml dung dịch phenol 5 %. Sau đó cho chính xác vào ống nghiệm 5 ml H2SO4đậm đặc.
Để 10 phút rồi lắc và giữ trên nồi cách thủy 10 – 20 phút ở 25 – 30 oC để xuất hiện màu. Xác định cường độ màu trong quang phổ kếở bước sóng 490 nm
Xây dựng đồ thị mẫu
Lấy 7 bình định mức 100 ml rồi cho vào đó theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ml dung dịch saccharose 0.1% mẫu trên, cho nước cất vào đến vạch định mức. Từ mỗi bình lấy ra 1 ml cho vào ống nghiệm rồi nhuộm bằng phenol và H2SO4 như đã nói ở trên. Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương đương 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 μg saccharose. So màu rồi vẽđồ thị mẫu. Mẫu thử không với 1ml nước cất thế dung dịch đường
v. Phương pháp định lượng cellulose Nguyên tắc
Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền đối với tác dụng của acid mạnh và kiềm mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu còn các chất khác thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, lignin… ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm, nên bị oxy hóa phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu và dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp acid nitrit với acid acetic
Tiến hành
Cân 2 g hạt cacao đã nghiền nhỏ (sấy khô đến trọng lượng không đổi ở 100 – 105
oC), cho vào bình tam giác dung tích 250 ml
Thêm vào bình 16.5 ml hỗn hợp gồm 1.5 ml acid nitric đậm đặc và 15 ml acid acetic đặc. Lắp ống làm lạnh hồi lưu vào bình và đun sôi hỗn hợp 30 phút. Để nguội, pha loãng hỗn hợp bằng nước nóng. Lọc qua giấy lọc đã biết trước trọng lượng
Rửa kết tủa cellulose 3 lần bằng nước cất nóng (mỗi lần từ 10 – 15 ml) Rửa bằng rượu ethylic 96 % 1 – 2 lần, mỗi lần 10 – 15 ml
Rửa bằng ete ethylic
Sấy giấy lọc có chứa cellulose ở nhiệt độ 100 – 105 oC đến trọng lượng không
đổi (2 – 3 giờ). Tùy theo nồng độ của thuốc thử đem dùng, cùng với cellulose thường còn lại một hàm lượng nhỏ hemicellulose chủ yếu là pentosan và lignin. Do đó cellulose xác định gọi là cellulose thô
Tính kết quả
.100 a X w = Trong đó X: hàm lượng cellulose tính bằng % a: trọng lượng cellulose (g) w: trọng lượng mẫu thí nghiệm (g) 100: hệ số chuyển thành %
vi. Phương pháp định lượng pectin Nguyên tắc
Phương pháp dựa trên cơ sở thu nhận muối canxi pectat ở dạng kết tủa
Tiến hành
Cân 0.15 g mẫu hạt cacao có chứa pectin vào becher 100 ml Cho thêm 100 ml NaOH 0,1 N
Để hỗn hợp trong 7 giờ hoặc qua đêm để xà phòng hóa hoàn toàn pectin thành acid pectic
Thêm 50 ml dung dịch CH3COOH
Sau 5 phút thêm 50 ml dung dịch CH3COOH
Đun sôi 5 phút và lọc qua giấy lọc không tro đã được sấy khô tới trọng lượng không đổi
Rửa kết tủa canxi pectat bằng nước cất nóng cho tới khi không còn ion clo nữa (thử nước rửa với dung dịch bạc nitrat 1 % không có kết tủa trắng)
Sau khi rửa xong cho giấy lọc có kết tủa vào chén cân và sấy ở 105 oC cho đến khi trọng lượng không đổi
Tính kết quả
Hàm lượng của canxi pectat bằng hiệu của trọng lượng giấy lọc có kết tủa và giấy lọc không
Hàm lượng pectin (P) tính theo công thức sau:
.0,92.100 w P B = Trong đó
B: lượng pectin lấy đem xà phòng hóa khoảng 0.15 (g)
0.92: Hệ số chuyển đã trừ hàm lượng canxi trong kết tủa (nghĩa là pectin chiếm 92 % trọng lượng canxi pectat)
100: hệ số chuyển để biểu thị kết quả theo %.