Các thí nghiệm về Bacillus subtilis

3.4.2.1. Ảnh hƣởng của chế độ nuơi cấy (nuơi cấy tĩnh, nuơi cấy lắc) và thời gian nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn

 Nguyên tắc

Khi nuơi cấy vi sinh vật trong cùng một loại mơi trường nhưng khác nhau về thời gian và chế độ nuơi cấy (Nuơi cấy tĩnh và nuơi cấy lắc) thì cho lượng sinh khối khác nhau.

 Mục đích

Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm 1

Thời gian

Mơi trường

Nuơi cấy tĩnh Nuơi cấy lắc 24h

36h 48h

 Cách làm

Cấy vi khuẩn Bacillus subtilis từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 - 5 ml mơi trường TSB đã được hấp tiệt trùng (121oC/15 phút), đem đi ủ ở 37o

C trong 24 giờ.

Sau đĩ, cấy vi khuẩn từ ống nghiệm vào bình tam giác chứa 50ml mơi trường TSB với tỉ lệ 2%, nuơi cấy trong 2 chế độ khác nhau: nuơi cấy tĩnh và nuơi cấy lắc (lắc 15 phút, nghỉ 45 phút) ở điều kiện 37oC.

Kiểm tra số lượng vi khuẩn sau thời gian 24, 36, 48 giờ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.

Từ khảo sát trên chúng tơi chọn được chế độ nuơi cấy vi khuẩn Bacillus subtiis

thích hợp để tiếp tục khảo sát thi nghiệm tiếp theo.

3.4.2.2. Khảo sát mơi trƣờng và thời gian nuơi cấy thích hợp cho vi khuẩn

Bacillus subtilis phát triển tạo sinh khối

 Nguyên tắc

Khi nuơi cấy vi khuẩn trong các loại mơi trường khác nhau ở điều kiện nuơi cấy giống nhau (pH, nhiệt độ, thời gian nuơi cấy) thì số lượng vi khuẩn sẽ khác nhau.

 Mục đích

Xác định mơi trường nuơi cấy nào là thích hợp.

 Cách làm

Cấy vi khuẩn từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 – 5 ml mơi trường TSB, ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Sau đĩ, chuyển vi khuẩn từ ống nghiệm vào 4 loại mơi trường khác nhau: TSB, TSB + 1% glucose, TSB + 1% cao nấm men, TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men (với tỉ lệ 2%).

Sau đĩ đem nuơi cấy ở chế độ đã được chọn ra từ thí nghiệm 1, đếm số lượng vi khuẩn sau 24, 36, 48 giờ nuơi cấy bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.

Từ khảo sát trên chúng tơi chọn được loại mơi trường nuơi cấy thích hợp để tiếp tục khảo sát thí nghiệm tiếp theo.

Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm 2

Thời gian (giờ)

Mơi trường

TSB TSB+1%Glucose TSB + 1%Cao nấm men TSB + 1%Glucose + 1%Cao nấm men 24

36 48

3.4.2.3. Khảo sát pH, mơi trƣờng thích hợp nuơi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis

 Nguyên tắc

Mỗi loại vi khuẩn thích hợp với một độ pH khác nhau, vì vậy khi nuơi cấy vi khuẩn trong cùng một loại mơi trường nhưng ở các độ pH khác nhau thì số lượng vi khuẩn phát triển sau cùng một khoảng thời gian là khác nhau.

Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm 4 Thời gian (giờ) pH 7,0 7,5 Nhiệt độ phịng 37oC Nhiệt độ phịng 37oC 24 36 48

 Mục đích

Xác định pH mơi trường nuơi cấy thích hợp.

 Cách làm

Cấy vi khuẩn từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 -5 ml mơi trường TSB, ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Sau đĩ, chuyển vi khuẩn từ ống nghiệm vào mơi trường được chọn từ thí nghiệm 2 ở các pH khác nhau với tỉ lệ 2% và nuơi cấy ở chế độ nuơi cấy (1).

Sau 48 giờ đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.

Từ thí nghiệm chúng tơi chọn ra pH mơi trường nuơi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp.

3.4.3. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis

3.4.3.1. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis

 Cách làm

Cấy vi khuẩn từ ơng giống vào ống nghiệm chứa 4 – 5 ml mơi trường TSB, ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Sau đĩ, chuyển vi khuẩn vào mơi trường đã được chọn từ các thí nghiệm trên. Sau thời gian nuơi cấy thích hợp chúng tơi xử lí nhiệt độ.

Xử lí ở 50oC và 70oC, đếm số lượng bào tử hình thành sau 3, 5, 7 giờ xử bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (xem phần phụ lục)

Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm 4 Thời gian (giờ) Nhiệt độ 50oC 70oC 3 5 7

3.4.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis

 Cách làm

Cấy vi khuẩn từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 – 5 ml mơi trường TSB, ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Sau đĩ, chuyển vi khuẩn vào mơi trường đã được chọn từ các thí nghiệm trên. Sau thời gian nuơi cấy thích hợp chúng tơi xử lí pH.

Đếm số lượng bào tử hình thành sau 3, 5, 7 giờ xử lí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm 5 Thời gian (giờ) pH 6 9 3 5 7

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis

4.1.1. Đặc điểm hình thái của Bacillus sutilis

Sau khi tiêu bản vi khuẩn được nhuộm Gram và được quan sát trên kính hiển vi ở độ phĩng đại 1000 lần, chúng tơi nhận thấy vi khuẩn Bacillus subtilis là :

 Trực khuẩn bắt màu Gram dương, ngắn và nhỏ.

 Kích thước từ 0,5 - 0,8 µm x 1,5 -3 µm, hai đầu trịn, đơi khi nối thành chuỗi dài, cĩ tạo bào tử khơng làm phình tế bào.

Hình 4.1. Tế bào vi khuẩn B. subtilis dƣới kính hiển vi ở độ phĩng đại 1000 lần

: www.answers.com/ topic/bacillus-1

4.1.2. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis

Vi khuẩn được cấy trên mơi trường TSA, sau 24 giờ cho thấy hình dạng của khuẩn lạc: khuẩn lạc khơ, cĩ màu xám nhạt trắng, tạo ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, cĩ mép nhăn, mép lồi lõm, bám chặt vào mơi trường thạch.

4.1.3. Quan sát dăc điểm nuơi cấy Bacillus subtilis trên mơi trƣờng canh

Sau khi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis vào mơi trường canh TSB, đem ủ ở 37oC:  Sau 12 giờ thì vi khuẩn làm đục mơi trường.

 Nuơi cấy đến 24 giờ thì thấy vi khuẩn tạo váng trển bề mặt của mơi trường và làm cho mơi trường ở phía dưới trong hơn.

4.1.3. Tính chất sinh hố

Bảng 4.1. Các phản ứng sinh hố khác của Bacillus subtilis

Thử nghiệm Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh Indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử Nitrate + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose +

Ghi chú: (-) là kết quả âm tính (+) là kết quả dương tính

Qua bảng cho thấy kết quả khảo sát của chúng tơi phù hợp với tính chất sinh hố của Bacillus subtilis (Nguyễn Vĩnh Phước, 1976).

Ngồi ra chung tơi cịn khảo sát thấy được rằng Bacillus subtilis cĩ khả năng sử dụng các chất như: glucose, citrate, hợp chất chứa nitrogen và cĩ khả năng di động.

Tuy nhiên, Bacillus subtilis lại khơng cĩ enzyme tryptophase để phân giải tryptophan tạo Indol.

Hình 4.4. Phản ứng lên men một số loại đƣờng của vi khuẩn Bacillus subtilis

 Khả năng phân giải tinh bột

Chúng tơi đã tiến hành khảo sát khả năng sử dụng tinh bột bằng cách đo đường kính vịng phân giải trên mơi trường thạch tinh bột (Starch agar) và thu được kết quả đường kính vịng phân giải trung bình là 2,9 cm.

Hình 4.3. Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên mơi trƣờng thạch tinh bột.

4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtilis

4.2.1. Khảo sát chế độ (nuơi cấy tĩnh, lắc) và thời gian nuơi cấy thích hợp

Chúng tơi tiến hành:

 Nuơi cấy vi khuẩn trong mơi trường TSB ở hai chế độ nuơi cấy khác nhau: nuơi cấy tĩnh và nuơi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ).

 Đếm số lượng vi khuẩn ở 3 thời điểm: 24giờ, 36giờ, 48 giờ bằng phương pháp đỗ đĩa (thí nghiệm được lặp lại 2 lần).

Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian và chế độ nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis

Thời gian (giờ)

Chế độ nuơi cấy

Nuơi cấy lắc Nuơi cấy tĩnh

12 10,15 8,79

18 11,07 9,92

24 11,16 9,95

X 10,79 9,55

(Số lượng vi khuẩn/ml tính theo logarit)

0 2 4 6 8 10 12 12 18 24

Thời gian (giờ) Số lƣợng vi

k huẩn (tính theo

logarit)

Nuơi cấy lắc Nuơi cấy tĩnh

Biểu đồ 4.1 Ảnh hƣởng của chế độ và thời gian nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn B. subtilis

Qua kết quả ở bảng 4.1 cho thấy số lượng vi khuẩn trung bình trong 1 ml canh khuẩn ở chế độ nuơi cấy lắc là 10,79 (giá trị logarit) (số thực tế là 6,17.1010) cao hơn so với số lượng vi khuẩn trung bình ở chế độ nuơi cấy tĩnh 9,55 (giá trị logarit) (số thực tế là 35,48.108).

Kết quả xử lí thống kê cho thấy rằng cĩ sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa hai chế độ nuơi cấy tĩnh và lắc, sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (với

P<0,05). Điều này cĩ nghĩa là khi nuơi cấy lắc thì lượng oxy và chất dinh dưỡng sẽ phân bố đồng đều hơn trong mơi trường giúp cho vi khuẩn phát triển nhanh hơn khi

nuơi cấy tĩnh (vì Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nên khi cung cấp nhiều oxy hơn thì chúng sinh sản và phát triển mạnh hơn).

Kết quả xử lí thống kê cũng cho thấy rằng cĩ sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa các khoảng thời gian nuơi cấy (12 giờ, 18 giờ và 24 giờ) (với P<0,05).

Qua bảng kết quả, khi nuơi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis sau 24 giờ ở chế độ nuơi cấy lắc thì cho số lượng tế bào vi khuẩn là 11,16 (giá trị logarit) cao hơn ở các mức thời gian 12 giờ, 18 giờ (10,15; 11,07).

Vì vậy, chúng tơi quyết định chọn chế độ nuơi cấy lắc để khảo sát số lương vi khuẩn trong các loại mơi trường nuơi cấy khác nhau ở thí nghiệm tiếp theo.

4.2.2. Khảo sát mơi trƣờng và thời gian nuơi cấy thích hợp

Từ kết quả của thí nghiệm 1, chúng tơi tiến hành nuơi cấy để xác định số lượng vi khuẩn trên 4 loại mơi trường:

 TSB.

 TSB + 1% glucose.  TSB + 1% cao nấm men.

 TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men.

Ở điều kiện 37oC, nuơi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ) với tỉ lệ giống 2%. Đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đỗ đĩa vào các thời điểm: 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ (thí nghiệm được lặp lại 2 lần).

Kết quả thí nghiệm được trình bày qua Bảng 4.2 và Biểu đồ 4.2.

Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của mơi trƣờng và thời gian nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis

Thời gian (giờ) Mơi trường TSB TSB + 1% glucose TSB+ 1% cao nấm men TSB+1% glucose+ 1% cao nấm men X 24 11,08 11,25 11,32 11,28 11,23 36 11,19 11,36 11,40 11,37 11,33 48 11,30 11,44 11,49 11,46 11,43 X 11,19 11,35 11,4 11,37

0 2 4 6 8 10 12 14 24 36 48 Thời gian (giờ) Số lƣợng vi khuẩn (Tính theo logarit) TSB TSB+1%glucose

TSB+1%cao nấm men TSB+1%glucose+1%cao nấm men

Biểu đồ 4.2. Ảnh hƣởng của thời gian và mơi trƣờng nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis

Qua kết quả trình bày ở Bảng 4.2 cho thấy số lượng vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn của mơi trường TSB + 1% cao nấm men là 11,4 (giá trị logarit) (số thực tế là 25,19.1010) cao hơn số lượng vi khuẩn trung bình trong 1 ml canh khuẩn của các mơi trường TSB, TSB + 1% glucose và TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men. Và số lượng vi khuẩn trung bình ở thời gian nuơi cấy 48 giờ là 11,43 (giá trị logarit) (số thực tế 26,6.1010) cao hơn số lượng vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn khi nuơi cấy ở các mức thời gian khác.

Kết quả xử lí thống kê cho thấy khơng cĩ sự khác biệt giữa 3 loại mơi trường TSB, TSB + 1% glucose và TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men. Nhưng cĩ sự khác biệt giữa mơi trường TSB với 3 loại mơi trường trên.

Kết quả xử lí thống kê cũng cho thấy cĩ sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa các khoảng thời gian nuơi cấy (24 giờ, 36 giờ và 48 giờ) với (P<0,05).

Từ kết quả trên, chúng tơi chọn mơi trường TSB + 1% cao nấm men và thời gian nuơi cấy 48 giờ để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo.

4.2.3. Khảo sát pH, thời gian và nhiệt độ nuơi cấy vi khuẩn thích

Từ kết quả của các thí nghiệm 1 và 2, chúng tơi tiến hành nuơi cấy vi khuẩn trên mơi trường TSB + 1% cao nấm men ở 2 mức pH (7 và 7,5) trong điều kiện 37oC, nuơi cấy lắc (15 phút lắc,45 phút nghỉ) với tỉ lệ cấy giống 2% (thí nghiệm lặp lại 2 lần).

Đếm số lượng vi khuẩn sau thời gian nuơi cấy bằng phương pháp đỗ đĩa. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.3 .

Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ và thời gian nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis

Thời gian (giờ) pH 7,0 7,5 Nhiệt độ phịng 37oC Nhiệt độ phịng 37oC 24 10,83 11,37 10,85 11,25 36 10,96 11,45 10,92 11,33 48 11,05 11,54 11,00 11,40 X 10,95 11,45 10,93 11,33

(Số lượng vi khuẩn/ml tính theo logarit)

Qua kết quả Bảng 4.3 cho thấy số lượng vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn ở pH = 7 và nhiệt độ 37oC là 11,45 (giá trị logarit) (giá trị thực tế 28,18.1010) cao hơn số lượng vi khuẩn trung bình ở các điều kiện khác (pH = 7 ở nhiệt độ phịng, pH = 7,5 ở nhiệt độ phịng và pH = 7,5 ở 37oC).

Qua kết quả xử lý thống kê cho thấy cĩ sự khác biệt giữa các điều kiện nuơi cấy trên, sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,05).

0 2 4 6 8 10 12 14

24 36 48 Thời gian (giờ)

Số lƣợng vi khuẩn (tính theo

logarit)

pH 7, nhđộ phịng pH 7, 37 độ C pH 7.5, nhđộ phịng pH 7.5, 37 độ C

Biểu đồ 4.3. Ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ và thời gian nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis

Kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy rằng cĩ sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa các khoảng thời gian nuơi cấy (24 giờ, 36 giờ và 48 giờ) (P<0,05). Vậy khi nuơi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis trong mơi trường cĩ pH = 7, ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ cho số lượng tế bào vi khuẩn cao nhất.

4.2.4. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis

4.2.4.1. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của

Bacillus subtilis

Từ kết quả của các thí nghiệm 1, 2 và 3,chúng tơi tiến hành nuơi cấy vi khuẩn trên mơi trường TSB + 1% cao nấm men, pH = 7, ở trong điều kiện 37oC, nuơi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ), thời gian nuơi cấy là 48 giờ.

Sau 48 giờ nuơi cấy, chúng tơi tiến hành xử lí nhiệt độ (50oC và 70oC).

Lần lượt đếm số lượng bào tử vi khuẩn hình thành sau 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ xử lí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (thí nghiệm được lặp lại 2 lần).

Kết quả được trình bày ở Bảng 4.4 và Biểu đồ 4.4.

Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử vi khuẩn B. subtilis

Thời gian (giờ) Nhiệt độ (o C) X 37 50 70 0 5,65 5,65 5,65 5,65 3 5,81 5,9 5,92 5,87 5 6,37 6,97 6,85 6,73 7 7,12 8,75 8,81 8,23 X 6,22 6,82 6,81

(Số lượng vi khuẩn/ml tính theo logarit)

Qua kết quả của chúng tơi được trình bày ở Bảng 4.4, số lượng bào tử hình thành trung bình trong 1 ml canh khuẩn sau khi xử lí 50oC là 6,82 (giá trị logarit) (số thực tế là 6,6.106 bào tử/1ml) cao hơn số lượng bào tử hình thành trung bình trong 1 ml canh khuẩn sau khi xử lí 70oC và đối chứng (37oC).

Qua kết quả xử lý thống kê cho thấy cĩ sự khác biệt khi xử lý nhiệt độ (50oC, 70oC) so với khơng xử lý (37oC) và sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (P< 0,05). Tuy nhiên, kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy khi xử lý nhiệt độ 50oC và 70oC thì sự khác biệt khơng cĩ ý nghĩa (P>0,05).

0 2 4 6 8 10 0 3 5 Th7ời gian (giờ) Số lƣợng vi khuẩn (tính theo logarit) 37 độ C 50 độ C 70 độ C

Biểu đồ 4.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn B. subtilis

Qua Bảng 4.4 cũng thấy được số lượng bào tử hình thành tăng dần qua thời gian xử lí, số lượng bào tử trung bình sau 7 giờ xử lí là 8,81 (giá trị logarit) (số thực tế 64,5.107) cao hơn số lượng bào tử trung bình ở 3 giờ và 5 giờ xử lí nhiệt độ. Kết quả xử lí thống kê cho thấy cĩ sự khác biệt giữa các khoảng thời gian xử lí nhiệt độ (3 giờ, 5 giờ và 7 giờ), sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (P<0.05)

Từ kết quả của thí nghiệm, chúng tơi thấy rằng khi xử lý nhiệt độ (50oC, 70oC) cĩ ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử theo thời gian. Cĩ thể, do thời gian xử lý nhiệt độ và theo dõi ngắn nên khơng thấy được sự tác động khác nhau của 2 mức nhiệt độ này.

4.2.4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn

Bacillus subtilis

Chúng tơi tiến hành nuơi cấy vi khuẩn trên mơi trường TSB + 1% cao nấm men, pH = 7, ở trong điều kiện 37oC, nuơi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ), nuơi cấy trong thời gian 48 giờ.

Sau 48 giờ nuơi cấy, chúng tơi tiến hành xử lí pH (pH = 6 và pH = 9).

Lần lượt đếm số lượng bào tử vi khuẩn hình thành sau 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ xử lí