Vi khuẩn được cấy trên mơi trường TSA, sau 24 giờ cho thấy hình dạng của khuẩn lạc: khuẩn lạc khơ, cĩ màu xám nhạt trắng, tạo ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, cĩ mép nhăn, mép lồi lõm, bám chặt vào mơi trường thạch.
4.1.3. Quan sát dăc điểm nuơi cấy Bacillus subtilis trên mơi trƣờng canh
Sau khi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis vào mơi trường canh TSB, đem ủ ở 37oC: Sau 12 giờ thì vi khuẩn làm đục mơi trường.
Nuơi cấy đến 24 giờ thì thấy vi khuẩn tạo váng trển bề mặt của mơi trường và làm cho mơi trường ở phía dưới trong hơn.
4.1.3. Tính chất sinh hố
Bảng 4.1. Các phản ứng sinh hố khác của Bacillus subtilis
Thử nghiệm Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh Indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử Nitrate + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose +
Ghi chú: (-) là kết quả âm tính (+) là kết quả dương tính
Qua bảng cho thấy kết quả khảo sát của chúng tơi phù hợp với tính chất sinh hố của Bacillus subtilis (Nguyễn Vĩnh Phước, 1976).
Ngồi ra chung tơi cịn khảo sát thấy được rằng Bacillus subtilis cĩ khả năng sử dụng các chất như: glucose, citrate, hợp chất chứa nitrogen và cĩ khả năng di động.
Tuy nhiên, Bacillus subtilis lại khơng cĩ enzyme tryptophase để phân giải tryptophan tạo Indol.
Hình 4.4. Phản ứng lên men một số loại đƣờng của vi khuẩn Bacillus subtilis
Khả năng phân giải tinh bột
Chúng tơi đã tiến hành khảo sát khả năng sử dụng tinh bột bằng cách đo đường kính vịng phân giải trên mơi trường thạch tinh bột (Starch agar) và thu được kết quả đường kính vịng phân giải trung bình là 2,9 cm.
Hình 4.3. Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên mơi trƣờng thạch tinh bột.
4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtilis
4.2.1. Khảo sát chế độ (nuơi cấy tĩnh, lắc) và thời gian nuơi cấy thích hợp
Chúng tơi tiến hành:
Nuơi cấy vi khuẩn trong mơi trường TSB ở hai chế độ nuơi cấy khác nhau: nuơi cấy tĩnh và nuơi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ).
Đếm số lượng vi khuẩn ở 3 thời điểm: 24giờ, 36giờ, 48 giờ bằng phương pháp đỗ đĩa (thí nghiệm được lặp lại 2 lần).
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian và chế độ nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis
Thời gian (giờ)
Chế độ nuơi cấy
Nuơi cấy lắc Nuơi cấy tĩnh
12 10,15 8,79
18 11,07 9,92
24 11,16 9,95
X 10,79 9,55
(Số lượng vi khuẩn/ml tính theo logarit)
0 2 4 6 8 10 12 12 18 24
Thời gian (giờ) Số lƣợng vi
k huẩn (tính theo
logarit)
Nuơi cấy lắc Nuơi cấy tĩnh
Biểu đồ 4.1 Ảnh hƣởng của chế độ và thời gian nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn B. subtilis
Qua kết quả ở bảng 4.1 cho thấy số lượng vi khuẩn trung bình trong 1 ml canh khuẩn ở chế độ nuơi cấy lắc là 10,79 (giá trị logarit) (số thực tế là 6,17.1010) cao hơn so với số lượng vi khuẩn trung bình ở chế độ nuơi cấy tĩnh 9,55 (giá trị logarit) (số thực tế là 35,48.108).
Kết quả xử lí thống kê cho thấy rằng cĩ sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa hai chế độ nuơi cấy tĩnh và lắc, sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (với
P<0,05). Điều này cĩ nghĩa là khi nuơi cấy lắc thì lượng oxy và chất dinh dưỡng sẽ phân bố đồng đều hơn trong mơi trường giúp cho vi khuẩn phát triển nhanh hơn khi
nuơi cấy tĩnh (vì Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nên khi cung cấp nhiều oxy hơn thì chúng sinh sản và phát triển mạnh hơn).
Kết quả xử lí thống kê cũng cho thấy rằng cĩ sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa các khoảng thời gian nuơi cấy (12 giờ, 18 giờ và 24 giờ) (với P<0,05).
Qua bảng kết quả, khi nuơi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis sau 24 giờ ở chế độ nuơi cấy lắc thì cho số lượng tế bào vi khuẩn là 11,16 (giá trị logarit) cao hơn ở các mức thời gian 12 giờ, 18 giờ (10,15; 11,07).
Vì vậy, chúng tơi quyết định chọn chế độ nuơi cấy lắc để khảo sát số lương vi khuẩn trong các loại mơi trường nuơi cấy khác nhau ở thí nghiệm tiếp theo.
4.2.2. Khảo sát mơi trƣờng và thời gian nuơi cấy thích hợp
Từ kết quả của thí nghiệm 1, chúng tơi tiến hành nuơi cấy để xác định số lượng vi khuẩn trên 4 loại mơi trường:
TSB.
TSB + 1% glucose. TSB + 1% cao nấm men.
TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men.
Ở điều kiện 37oC, nuơi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ) với tỉ lệ giống 2%. Đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đỗ đĩa vào các thời điểm: 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ (thí nghiệm được lặp lại 2 lần).
Kết quả thí nghiệm được trình bày qua Bảng 4.2 và Biểu đồ 4.2.
Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của mơi trƣờng và thời gian nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis
Thời gian (giờ) Mơi trường TSB TSB + 1% glucose TSB+ 1% cao nấm men TSB+1% glucose+ 1% cao nấm men X 24 11,08 11,25 11,32 11,28 11,23 36 11,19 11,36 11,40 11,37 11,33 48 11,30 11,44 11,49 11,46 11,43 X 11,19 11,35 11,4 11,37
0 2 4 6 8 10 12 14 24 36 48 Thời gian (giờ) Số lƣợng vi khuẩn (Tính theo logarit) TSB TSB+1%glucose
TSB+1%cao nấm men TSB+1%glucose+1%cao nấm men
Biểu đồ 4.2. Ảnh hƣởng của thời gian và mơi trƣờng nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis
Qua kết quả trình bày ở Bảng 4.2 cho thấy số lượng vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn của mơi trường TSB + 1% cao nấm men là 11,4 (giá trị logarit) (số thực tế là 25,19.1010) cao hơn số lượng vi khuẩn trung bình trong 1 ml canh khuẩn của các mơi trường TSB, TSB + 1% glucose và TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men. Và số lượng vi khuẩn trung bình ở thời gian nuơi cấy 48 giờ là 11,43 (giá trị logarit) (số thực tế 26,6.1010) cao hơn số lượng vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn khi nuơi cấy ở các mức thời gian khác.
Kết quả xử lí thống kê cho thấy khơng cĩ sự khác biệt giữa 3 loại mơi trường TSB, TSB + 1% glucose và TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men. Nhưng cĩ sự khác biệt giữa mơi trường TSB với 3 loại mơi trường trên.
Kết quả xử lí thống kê cũng cho thấy cĩ sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa các khoảng thời gian nuơi cấy (24 giờ, 36 giờ và 48 giờ) với (P<0,05).
Từ kết quả trên, chúng tơi chọn mơi trường TSB + 1% cao nấm men và thời gian nuơi cấy 48 giờ để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo.
4.2.3. Khảo sát pH, thời gian và nhiệt độ nuơi cấy vi khuẩn thích
Từ kết quả của các thí nghiệm 1 và 2, chúng tơi tiến hành nuơi cấy vi khuẩn trên mơi trường TSB + 1% cao nấm men ở 2 mức pH (7 và 7,5) trong điều kiện 37oC, nuơi cấy lắc (15 phút lắc,45 phút nghỉ) với tỉ lệ cấy giống 2% (thí nghiệm lặp lại 2 lần).
Đếm số lượng vi khuẩn sau thời gian nuơi cấy bằng phương pháp đỗ đĩa. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.3 .
Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ và thời gian nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis
Thời gian (giờ) pH 7,0 7,5 Nhiệt độ phịng 37oC Nhiệt độ phịng 37oC 24 10,83 11,37 10,85 11,25 36 10,96 11,45 10,92 11,33 48 11,05 11,54 11,00 11,40 X 10,95 11,45 10,93 11,33
(Số lượng vi khuẩn/ml tính theo logarit)
Qua kết quả Bảng 4.3 cho thấy số lượng vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn ở pH = 7 và nhiệt độ 37oC là 11,45 (giá trị logarit) (giá trị thực tế 28,18.1010) cao hơn số lượng vi khuẩn trung bình ở các điều kiện khác (pH = 7 ở nhiệt độ phịng, pH = 7,5 ở nhiệt độ phịng và pH = 7,5 ở 37oC).
Qua kết quả xử lý thống kê cho thấy cĩ sự khác biệt giữa các điều kiện nuơi cấy trên, sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,05).
0 2 4 6 8 10 12 14
24 36 48 Thời gian (giờ)
Số lƣợng vi khuẩn (tính theo
logarit)
pH 7, nhđộ phịng pH 7, 37 độ C pH 7.5, nhđộ phịng pH 7.5, 37 độ C
Biểu đồ 4.3. Ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ và thời gian nuơi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis
Kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy rằng cĩ sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa các khoảng thời gian nuơi cấy (24 giờ, 36 giờ và 48 giờ) (P<0,05). Vậy khi nuơi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis trong mơi trường cĩ pH = 7, ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ cho số lượng tế bào vi khuẩn cao nhất.
4.2.4. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis
4.2.4.1. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của
Bacillus subtilis
Từ kết quả của các thí nghiệm 1, 2 và 3,chúng tơi tiến hành nuơi cấy vi khuẩn trên mơi trường TSB + 1% cao nấm men, pH = 7, ở trong điều kiện 37oC, nuơi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ), thời gian nuơi cấy là 48 giờ.
Sau 48 giờ nuơi cấy, chúng tơi tiến hành xử lí nhiệt độ (50oC và 70oC).
Lần lượt đếm số lượng bào tử vi khuẩn hình thành sau 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ xử lí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (thí nghiệm được lặp lại 2 lần).
Kết quả được trình bày ở Bảng 4.4 và Biểu đồ 4.4.
Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử vi khuẩn B. subtilis
Thời gian (giờ) Nhiệt độ (o C) X 37 50 70 0 5,65 5,65 5,65 5,65 3 5,81 5,9 5,92 5,87 5 6,37 6,97 6,85 6,73 7 7,12 8,75 8,81 8,23 X 6,22 6,82 6,81
(Số lượng vi khuẩn/ml tính theo logarit)
Qua kết quả của chúng tơi được trình bày ở Bảng 4.4, số lượng bào tử hình thành trung bình trong 1 ml canh khuẩn sau khi xử lí 50oC là 6,82 (giá trị logarit) (số thực tế là 6,6.106 bào tử/1ml) cao hơn số lượng bào tử hình thành trung bình trong 1 ml canh khuẩn sau khi xử lí 70oC và đối chứng (37oC).
Qua kết quả xử lý thống kê cho thấy cĩ sự khác biệt khi xử lý nhiệt độ (50oC, 70oC) so với khơng xử lý (37oC) và sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (P< 0,05). Tuy nhiên, kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy khi xử lý nhiệt độ 50oC và 70oC thì sự khác biệt khơng cĩ ý nghĩa (P>0,05).
0 2 4 6 8 10 0 3 5 Th7ời gian (giờ) Số lƣợng vi khuẩn (tính theo logarit) 37 độ C 50 độ C 70 độ C
Biểu đồ 4.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn B. subtilis
Qua Bảng 4.4 cũng thấy được số lượng bào tử hình thành tăng dần qua thời gian xử lí, số lượng bào tử trung bình sau 7 giờ xử lí là 8,81 (giá trị logarit) (số thực tế 64,5.107) cao hơn số lượng bào tử trung bình ở 3 giờ và 5 giờ xử lí nhiệt độ. Kết quả xử lí thống kê cho thấy cĩ sự khác biệt giữa các khoảng thời gian xử lí nhiệt độ (3 giờ, 5 giờ và 7 giờ), sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (P<0.05)
Từ kết quả của thí nghiệm, chúng tơi thấy rằng khi xử lý nhiệt độ (50oC, 70oC) cĩ ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử theo thời gian. Cĩ thể, do thời gian xử lý nhiệt độ và theo dõi ngắn nên khơng thấy được sự tác động khác nhau của 2 mức nhiệt độ này.
4.2.4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn
Bacillus subtilis
Chúng tơi tiến hành nuơi cấy vi khuẩn trên mơi trường TSB + 1% cao nấm men, pH = 7, ở trong điều kiện 37oC, nuơi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ), nuơi cấy trong thời gian 48 giờ.
Sau 48 giờ nuơi cấy, chúng tơi tiến hành xử lí pH (pH = 6 và pH = 9).
Lần lượt đếm số lượng bào tử vi khuẩn hình thành sau 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ xử lí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn B. subtilis Thời gian (giờ) pH X 7 6 9 0 5,49 5,49 5,49 5,49 3 5,9 6,03 5,99 5,97 5 6,17 6,75 6,9 6,61 7 6,98 8,41 8,35 7,91 X 6,14 6,78 6,68
(Số lượng vi khuẩn/ml tính theo logarit)
Qua kết quả Bảng 4.5, cho thấy số lượng bào tử hình thành trung bình trong 1ml canh khuẩn sau khi xử lí pH = 6 là 6,78 (giá trị logarit) (số thực tế là 6,03.106 bào tử/1ml) cao hơn sau khi xử lí pH = 9 và đối chứng (pH = 7).
Kết quả xử lý thống kê cho thấy cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa về mặt thống kê giữa việc xử lý pH và khơng xử lý pH đến sự hình thành bào tử. Nhưng khi xử lý pH = 6 và pH = 9 thì lại cĩ sự khác biệt khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (P> 0,05).
Bảng kết quả cũng cho thấy số lượng bào tử vi khuẩn hình thành tăng dần theo thời gian, số lượng bào tử hình thành trung bình sau 7 giờ xử lí là 7,91 (giá trị logarit) (số thực tế là 8,13.107) cao hơn số lượng bào tử trung bình ở 3 và 5 giờ xử lí. Qua kết quả xử lí thống cũng cho thấy cĩ sự khác biệt cĩ ý nghĩa về mặt thống kê giữa các mức thời gian xủ lí pH (3 giờ, 5 giờ và 7 giờ).
Từ kết quả trên, chúng tơi nhận thấy cĩ sự tác động trong việc xử lí pH (pH6, pH9) đến sự hình thành bào tử theo thời gian , tuy nhiên lại khơng thể nhận thấy sự khác nhau trong tác động khác nhau giữa hai mức pH này. Cĩ thể, do thời gian xử lí và theo dõi của chúng tơi ngắn nên khơng thể nhận thấy được sự tác động khác nhau của hai mức pH này.
Qua hai bảng kết quả Bảng 4.4 và Bảng 4.5, chúng tơi so sánh thấy cĩ sự khác biệt về số lượng bào tử trung bình khi xử lí bào tử bằng nhiệt độ so với xử lí bằng pH. Tuy nhiên kết quả xử lí thống kê cho thấy giữa hai cách xử lí bào tử cĩ sự khác biệt khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê.
0 2 4 6 8 10
0 3 5 7 Thời gian (giờ)
Số lƣợng vi khuẩn (tính theo
logarit)
pH 7 pH 6 pH 9
Biểu đồ 4.5. Ảnh hƣởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn B. subtilis
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Sau thời gian thực hiện đề tài chúng tơi đã rút ra những kết luận sau:
Đặc điểm sinh học, sinh hố của vi khuẩn Bacillus subtilis do phịng thí nghiệm vi sinh khoa Chăn nuơi Thú y cung cấp cho thấy các đặc điểm về hình thái nuơi cấy và phản ứng sinh hố phù hợp.
Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nuơi cấy tĩnh và nuơi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ) thì chế độ nuơi cấy lắc cho số lượng vi khuẩn cao hơn.
Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại mơi trường khác nhau (TSB, TSB + 1% glucose, TSB + 1% cao nấm men, TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men) thì mơi trường TSB cho số lượng vi khuẩn thấp nhất, 3 mơi trường cịn lại là những mơi trường phù hợp cho Bacillus subtilis phát triển.
Khảo sát ảnh hưởng của pH mơi trường (pH 7 và 7,5), thời gian (24,36 và 48 giờ) và nhiệt độ nuơi cấy (nhiệt độ phịng, 37oC) thì ở pH 7, thời gian 48 giờ và nhiệt độ nuơi cấy 37oC cho số lượng vi khuẩn lớn nhất.
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ (50, 70), pH (6, 9) và thời gian xử lí (3, 5 và 7 giờ) đến sự hình thành bào tử thì khi xử lí ở các nhiệt độ và pH này cĩ sự ảnh hưởng đến quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis.
5.2. Đề nghị
Khảo sát thêm nhiều chủng vi khuẩn Bacillus subtilis để chọn chủng cĩ khả năng phát triển mạnh.
Khảo sát thêm nhiều loại mơi trường, nhiệt độ, pH và thời gian nuơi cấy để xác định điều kiện thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển.
Khảo sát thêm nhiều điều kiện xử lý bào tử để tìm được điều kiện thích hợp cho sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Đức Duy Anh, 2005. Phân lập và khảo sát một số đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis. LVTN, bộ mơn cơng nghệ sinh học, Trường Đại Học Nơng Lâm Tp.HCM.
2. Tơ Minh Châu, 2000. Giáo rình thực tập vi sinh vật học..
3. Nguyễn Lân Dũng, 1983. Thực tập vi sinh vật. Nhà xuất bản đại học và trung học chuyên nghiệp Hà Nội.
4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Nguyên, Phạn Văn Ty, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Phùng Tiến, 1976. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập I, II, III. Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật.
5. Nguyễn Văn Đơng, 1993. Khảo sát một số tính chất của vi khuẩn Bacillus subtilis dùng sản xuất chế phẩm Biosubtyl phịng và trị bệnh tiêu chảy cho heo con. Luận văn tốt nghiệp khĩ Chăn Nuơi Thú y, trường Đại Học Nơng Lâm Tp.HCM.
6. Nguyễn Ngọc Hải, Tơ Minh Châu, 2001. Giáo trình thực tập vi sinh. Tủ sách trường Đại Học Nơng Lâm Tp.HCM.
7. Lý Kim Hữu, 2005. Khảo sát đặc điểm của Bacillus subtilis và tìm hiểu điều kiện nuơi cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic LVTN, khoa Chăn nuơi Thú y, trường Đại Học Nơng Lâm Tp.HCM.
8. Nguyễn Đức Lượng, 2001. Cơng nghệ sinh học. NXB ĐH Quốc gia Tp.HCM