Thực hiện quy trình PCR thoái hoá tối ƣu trên 9 mẫu DNA li trích, kết quả thể hiện trên gel điện di nhƣ sau:
Hình 4.18. Kết quả PCR thoái hoá trên 9 mẫu dứa Cayenne
Chú thích. Sản phẩm PCR thoái hoá: từ 1 – 9 các mẫu CMK1, CMK2, CMB, LĐK, LĐB, TLK, TLB, TQK, TQB; D: mẫu lan Dendrobium; L: DNA ladder;
S: sản phẩm PCR thoái hoá đƣợc tinh sạch với kích thƣớc khoảng 510 bp.
Hầu hết các mẫu dứa đều tạo sản phẩm PCR thoái hoá với rất nhiều band. Trong đó chỉ có hai band sáng và rõ nhất (khoảng 510 bp, khoảng 700 bp), band có kích thƣớc lớn hơn 1000 bp (khoảng 1400) mỏng và không đồng đều giữa các mẫu, các band còn lại khá mờ. Band khoảng 700 bp có phần sáng hơn so với band khoảng 510 bp. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR không có sự khác biệt lớn giữa các mẫu dứa (ngoại trừ mẫu 8 - TQK không cho sản phẩm – có thể do sai sót trong pha loãng hay ly trích cho nhiều tạp). Điều này cho thấy các mẫu biểu hiện và không biểu hiện triệu chứng của bệnh héo đỏ đầu lá không có sự khác biệt khi kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR thoái hoá và điện di.
Mẫu lan Dendrobium cũng cho kết quả clone vùng gene NBS khá tốt (band sáng rõ, kích thƣớc khoảng 510 bp). So sánh kết quả PCR thoái hoá giữa mẫu lan Dendrobium và dứa Cayenne cho thấy chỉ có sự giống nhau ở band khoảng 510 bp (vùng gene mã hoá cho cấu trúc NBS). Các band còn lại rất khác biệt nhau (mẫu lan không có band khoảng 700 bp, các band mờ có kích thƣớc nhỏ hơn cũng không có sự tƣơng đồng). Điều này chỉ ra rằng vùng gene mã hoá cho cấu trúc NBS có độ bảo tồn rất cao trên các loài cách xa nhau về phân loại.
4.2.7. Giải trình tự sản phẩm PCR thoái hoá
Việc có đƣợc trình tự của những thành viên họ gene NBS cho phép phân tích sâu hơn về tính kháng trên cây dứa Cayenne. Tuy nhiên, cố gắng giải trình tự trực
tiếp sản phẩm PCR thoái hoá đã không thành công. Nguyên nhân là do mồi sử dụng là mồi thoái hoá thay vì mồi chuyên biệt nhƣ thông thƣờng. Do đó hiện tƣợng nhiễu xảy ra gây khó khăn cho việc đọc trình tự.
Mặt khác, sản phẩm PCR thoái hoá thƣờng là một hỗn hợp đa trình tự. Vì vậy, mẫu sau khi đã tinh sạch để đƣa vào máy đọc vẫn có thể là một hỗn hợp nhiều gene. Và điều này cũng là một nguyên nhân gây nhiễu.