Từ cửa sổ chính của chƣơng trình Primrose thực hiện từng bƣớc cụ thể nhƣ sau – Tạo CSDL: Đƣa vào các file chứa trình tự của tất cả các vi khuẩn viêm
màng não mủ ở định dạng fasta (.fas).
Hình 3.9.Tạo CSDL trình tự gene 16S rRNA ở các vi khuẩn viêm màng não
– Chọn trình tự đích: ở đây chúng ta muốn phát hiện Streptococcus pneumoniae nên chọn trình tự đích là file Strepcococcus pneumoniae.fas
Hình 3.10. Chọn trình tự đích trong thiết kế mồi phát hiện Streptococcus pneumoniae dựa trên gene 16S rRNA.
– Tạo mồi: chúng ta xác định các thông số nhƣ chiều dài mồi, số base đƣợc cho phép biến đổi trong mồi…Chọn thẻ “Find oligonucleotide” để chƣơng trình tìm ra các mồi có thể có.
Hình 3.11. Xác định các thông số cho mồi và số lượng mồi được tạo ra trên trình tự đích 16S rRNA
– Kiểm tra lại tất cả các mồi với các trình tự trong CSDL đƣợc tạo ở bƣớc đầu tiên. Chƣơng trình sẽ loại bỏ các mồi bắt cặp với trình tự ngoài trình tự đích và trình bày danh sách các mồi thích hợp.
Hinh 3.12. Danh sách các mồi thiết kế được trên 16S rRNA
Việc tổ hợp các mồi đơn này thành một cặp mồi để thực hiện các phản ứng PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ chiều dài sản phẩm PCR, tính chuyên biệt của cặp mồi và sự tƣơng thích giữa hai mồi…
Ở đây chúng tôi chọn một cặp mồi cho đoạn sản phẩm có kích thƣớc vào khoảng 300-400 bp.
Mồi xuôi: đoạn oligonnucleotide 68 trong danh sách.
Forward primer 16S 5‟-AGAGGGGAGAGTGGAATTCC-3‟(sense) Mồi ngƣợc: đoạn oligonnucleotide 166
Reverse primer 16S 5‟-TTGACATCCCTCTGACSRCT-3‟ (sense) Trong đó S = (G hoặc C)
R = (A hoặc G)
Nhấp đúp chuột vào trình tự từng mồi để biết đƣợc các thông tin chi tiết nhƣ vị trí bắt cặp của mồi trên trình tự đích, số base trong mồi không bắt cặp (mismatch)…
Hình 3.14. Vị trí bắt cặp của mồi ngược trên trình tự đích 16S rRNA
Kiểm tra lại sự bắt cặp của cặp mồi này trên trình tự đích
Hinh 3.15. Kiểm tra sự bắt cặp của mồi ngược và mồi xuôi trên trình tự đích 16S rRNA
Hình 3.16. Kết quả kiểm tra sự bắt cặp mồi xuôi và mồi ngược trên trình tự đích gene 16S rRNA