2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp
Vi khuẩn là vật chủ lý tƣởng nhất cho việc đƣa DNA tái tổ hợp vào và biến chúng thành những nhà máy sản xuất ra những sản phẩm mà ta mong muốn. Những ƣu điểm cơ bản của vi khuẩn khi sử dụng chúng nhƣ những vật chủ để đƣa DNA tái tổ
hợp vào nhƣ sau: - Vi khuẩn có khả năng biến nạp. Khả năng này đƣợc Federick Griffith đƣa ra
từ năm 1928. Tuy nhiên khả năng này không phải tất cả vi khuẩn đều có mức độ nhƣ nhau.
- Vi khuẩn là cơ thể đơn bào, chúng có khả năng sinh sản, phát triển và trao đổi chất rất mạnh. Do đó nếu đƣa DNA tái tổ hợp vào vi khuẩn và chúng có khả năng biểu hiện đựoc tính trạng hợp lí mà ta mong muốn thì chỉ trong thời gian rất ngắn ta có thể thu nhận một lƣợng vật chấ lớn khổng lồ.
- Vi khuẩn phát triển mạnh trong các nồi lên men. Do đó ta hoàn toàn có khả năng tự động hóa, cơ giới hóa quá trình sản xuất.
Từ những ƣu điểm nổi bật trên mà các nhà khoa học đã nghiên cứu và đƣa ra những phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp hợp lý và rất dễ thực hiện.
2.4.1.1 Phƣơng pháp hóa biến nạp
Phƣơng pháp này có sự trợ giúp của CaCl2 kèm với làm sốc nhiệt để làm tăng khả năng biến nạp của vi khuẩn. Theo đó vi khuẩn chủ sẽ đƣợc trộn với DNA tái tổ hợp. Ngƣời ta cho vi khuẩn vào dung dịch CaCl2 lạnh và làm sốc nhiệt (nâng nhanh đến 420C trong 2 phút) sẽ làm tăng khả năng biến nạp lên nhiều lần.
Đối với tế bào động vật ta có thể thực hiện phƣơng pháp biến nạp bằng cách hấp thụ DNA tái tổ hợp qua trung gian phosphate calcium.
Đối với tế bào thực vật, ta cũng có khả năng tạo biến nạp. Tuy nhiên, việc đầu tiên là tạo tế bào trần (protoplast) thực vật bằng cách dùng enzyme cellulose phân hủy thành tế bào thực vật. Sau đó trộn tế bào trần này với DNA tái tổ hợp với sự có mặt của CaCl2 và polyethylenglycol. Tiếp theo ta lại nuôi tế bào trần trong môi trƣờng thích hợp để tái tạo lại thành tế bào nguyên thủy. Khi đó tế bào này mới phát triển thành cây trong những điều kiện tƣơng ứng.
2.4.1.2 Phƣơng pháp điện biến nạp
Ta có thể sử dụng xung điện để tế bào thực vật hấp thụ DNA tái tổ hợp. Bằng phƣơng pháp này ta thu đƣợc hiệu quả biến nạp rất cao.
2.4.2 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp
Sau khi xâm nhập, plasmid tái bản và thể hiện gen kháng kháng sinh trong tế bào chủ. Điều này giúp tế bào chủ có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng có kháng sinh. Do đó, khi trải E. coli biến nạp lên môi trƣờng chứa kháng sinh, chỉ tế bào nào đã thu nhận plasmid và biểu hiện gen kháng kháng sinh mới có thể sinh trƣởng. Các tế bào không tiếp nhận plasmid sẽ không sinh trƣởng đƣợc.
Tuy vậy, kết quả của phản ứng nối giữa đoạn DNA và vector đã đƣợc mở vòng là một tổ hợp bao gồm nhiều kết quả nối, đó là vector-vector, vector-DNA chèn. Do vậy, có những thể biến nạp có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng chứa kháng sinh nhƣng không mang gen mục tiêu. Việc sàng lọc các thể biến nạp mang gen mục tiêu đƣợc tiến hành theo nhiều phƣơng pháp. Phổ biến là các phƣơng pháp sau:
- Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp dựa trên việc quan sát màu xanh hay trắng của khuẩn lạc bằng α-complementation.
- Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lai (lai khuẩn lạc).
- Xác định gen đích trên plasmid trong thể biến nạp bằng PCR (PCR khuẩn lạc). Thông thƣờng, để phân tích một dòng ngƣời ta dung hai phƣơng pháp là khảo sát plasmid tái tổ hợp bằng cách tạo bản đồ cắt giới hạn và giải trình tự toàn bộ đoạn gen đích.
Nhiều plasmid vector (ví dụ họ pUC, pBluescript, pGEM và các plasmid có nguồn gốc từ các họ plasmid này) mang một đoạn ngắn của DNA E. coli chứa những trình tự điều hòa và mã hóa cho α-protein của β-galactosidase (đầu amin). Việc chèn vào đoạn này trình tự MCS chứa các vị trí cắt giới hạn duy nhất (vẫn duy trì khung đọc) sẽ tạo thêm vài amino axit trong α-protein mà không ảnh hƣởng tới chức năng của lacZ. Các vector loại này sẽ đƣợc sử dụng với các chủng chủ thể hiện phần đầu carboxyl của β-galactosidase. Hiện tƣợng α-complementation xảy ra khi hai protein bất hoạt của β-galactosidase E. coli (α, ω-protein ) kết hợp với nhau để tạo thành một enzym có chức năng. Các khuẩn lạc có α-complementation sẽ dễ dàng đƣợc phát hiện vì việc xuất hiện khuẩn lạc màu xanh trên môi trƣờng có chứa cơ chất tạo màu X-gal
(5-Bromo- 4- chloro-3-Indolyl –β-D-galactopyranoside). Hợp chất không màu X-gal bị phân cắt bởi β-galactosidase để cho galactose và một dẫn xuất của indoxyl. Dẫn xuất này, đến lƣợt nó bị oxy hóa trong không khí để tạo ra dẫn xuất dibromo-dichloro có màu xanh. Để có sự biểu hiện của β-galactosidase cần có chất kích hoạt là IPTG (đồng phân của galactose không bị nhận biết bởi β-galactosidase), đóng vai trò nhƣ là chất kích hoạt của gen lacZ.
Khi chèn đoạn DNA vào trình tự MCS của các vector (ví dụ pBluescript) sẽ làm ngăn cản việc tạo thành α-protein đầu amin. Do đó, hiện tƣợng α-complementation không thể xảy ra. Vì vậy, khuẩn lạc do thể biến nạp hình thành có màu trắng.
2.4.3 Chiết tách DNA plasmid
Với mong muốn thu nhận một số lƣợng lớn các bản sao plasmid, ngƣời ta sử dụng bộ máy di truyền của các tế bào chủ. Thông qua đó, plasmid đƣợc sao chép với số lƣợng lớn và tốc độ cực kì nhanh chóng theo tốc độ tăng trƣởng của tế bào chủ. Trƣớc hết, biến nạp plasmid vào tế bào chủ, sau đó nuôi cấy tế bào chủ trên môi trƣờng chọn lọc thích hợp thu nhận sinh khối tế bào. Quá trình tách chiết plasmid từ tế bào chủ là công đoạn cuối cùng nhằm thu nhận plasmid dƣới dạng tinh. Các quy trình tách chiết đều có các bƣớc chính là phá vỡ màng tế bào, biến tính DNA, tủa protein, cuối cùng là tủa DNA. Tuỳ theo từng phƣơng pháp cụ thể ngƣời ta sẽ sử dụng các tác nhân khác nhau trong từng công đoạn của quá trình tách chiết.
Có nhiều phƣơng pháp tách chiết plasmid từ tế bào chủ, chẳng hạn nhƣ: - Phƣơng pháp nhiệt độ cao
- Phƣơng pháp Lythium - Phƣơng pháp SDS-kiềm
2. 5 Điện di (Electrophoresis)
Kỹ thuật điện di trên gel rất quan trọng đối với ngƣời làm kỹ thuật di truyền, vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn nucleic acid hiển thị trực tiếp. Phƣơng pháp này dựa trên một đặc tính của nucleic acid là ở pH trung tính chúng mang điện tích âm nhờ các nhóm phosphate nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleotide. Điều đó có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dƣơng khi đặt chúng vào điện trƣờng. Kỹ thuật này đƣợc tiến hành trên một dung dịch đệm gel có tác dụng phân tách các phân tử nucleic acid theo kích thƣớc.
Loại gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân tách các phân tử, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các lỗ có trong gel. Có hai loại gel đƣợc sử dụng phổ biến là agarose và polyacryamid.
Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thƣờng dùng để phân tách những đoạn có kích thƣớc trong khoảng 0,5 – 20 kb. Gel đƣợc đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di đƣợc thực hiện theo phƣơng nằm ngang. Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện hình dƣới tia tử ngoại (UV) nhờ một hóa chất có tên là ethidium bromide (EtBr). Chất này có khả năng xen vào giữa các base của acid nucleic và dƣới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang.
Gel polyacrylamide dùng để tách các đoạn có kích thƣớc nhỏ, tức là dƣới 1000 cặp base. Thao tác với gel polyacrylamide phức tạp hơn với gel agarose. Do đó, gel này chỉ đƣợc sử dụng cho những mục đích đặc hiệu. Các ứng dụng chủ yếu của loại gel này là:
- Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp - Xác định trình tự DNA
- Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài dƣới 500 cặp base.
Gel đổ giữa hai tấm thuỷ tinh và phƣơng của điện di là phƣơng thẳng đứng.
Thực hiện nạp mẫu điện di
Điện di đƣợc thực hiện bằng cách đƣa các mẫu nucleic acid đã đƣợc trộn đều với loading buffer bơm vào các giếng của miếng gel trong dung dịch đệm TAE 0,5X hoặc TBE 0,5X và đặt một điện áp vào đó. Trạng thái đó đƣợc duy trì cho đến khi vạch cuối của loading buffer chạy tới đầu cuối của gel. Sau đó, bản gel đƣợc nhuộm trong dung dịch ethidium bromide và xem dƣới UV.
2.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nƣớc và ngoài nƣớc 2.6.1 Ngoài nƣớc 2.6.1 Ngoài nƣớc
Cohen và cộng sự (1973), đã thành công khi biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli bằng phƣơng pháp Calcium chloride.
Sambrook và cộng sự (1989), đƣa ra phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E. coli khả nạp, biến nạp plasmid vào tế bào theo phƣơng pháp hóa chất và sốc nhiệt, sau đó ông đƣa ra công thức tính hệ số biến nạp
N: hệ số biến nạp, tính bằng CFU/µg plasmid DNA A: số khuẩn lạc đếm đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc n: hệ số pha loãng
OV: thể tích ban đầu khi phục hồi (µl)
OP: thể tích dịch vi khuẩn đƣợc trải trên đĩa (µl)
Inoue và cộng sự(1990), đƣa ra công thức dung dịch TB sử dụng trong quá trình chuẩn bị tế bào khả nạp nhƣ sau:
10mM Pipes, 55mM MnCl2, 15mM CaCl2, 250mM KCl
Zhiming Tu và cộng sự (2004), nghiên cứu cải thiện phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp và nâng cao hệ số biến nạp plasmid sử dụng những chủng E. coli khác nhau. Kết quả nghiên cứu của ông cho thấy sử dụng tế bào ở đầu phage log ảnh hƣởng rất lớn đến sự thành công của việc chuẩn bị tế bào khả nạp. Giá trị OD600 thích hợp của dịch nuôi cấy khi chuẩn bị tế bào khả nạp với các chủng vi khuẩn nhƣ sau: XL-blue là từ 0.15-0.45, TG1 là từ 0.2-0.5, DH5α là từ 0.145-0.45. Nồng độ của CaCl2 sử dụng trong dung dịch TB tối ƣu là 75mM. Cũng trong nghiên cứu này Zhiming Tu cho thấy thời gian lƣu trữ tế bào khả nạp ở -20oC là 7 ngày, ở -70oC là 15 ngày.
2.6.2 Trong nƣớc
Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, trƣờng Đại Học Nông Lâm TPHCM, đã thực hiện thành công đề tài : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn
E. coli DH5α” bƣớc đầu xây dựng đƣợc quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp, quy trình tách chiết plasmid, tiến hành phủ đầu bằng cho đoạn DNA từ sản phẩm PCR, thiết lập phản ứng nối cho đoạn DNA trên với plasmid, thực hiện phản ứng PCR trên plasmid đã chèn.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp
Thời gian : Khoá luận đƣợc tiến hành từ ngày 14 tháng 02 năm 2006 đến ngày 14 tháng 08 năm 2006.
Địa điểm : Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh, Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật-Trƣờng Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α
Chủng vi khuẩn đã đột biến, có những thiếu hụt dùng để biến nạp và nhân nhanh số lƣợng bản sao plasmid hoặc cosmid.
Kiểu gen : supE44 ∆lacU169(Ф80lacZ∆M15)
hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1relA1.
Đột biến Ф80lacZ∆M15 cho phép xảy ra hiện tƣợng α-complementation với tiểu phần mang đầu amino của β-galactosidase đƣợc mã hoá bởi plasmid họ pUC (Hanahan 1983 ; Bwnthesda Research Laboratories 1986)
3.2.2 pBluescript II SK(+/-)
pBluescript phagemid (plasmid với vùng khởi đầu sao chép của phage) là vector nhân tạo, đƣợc thiết kế để sử dụng trong cloning và đọc trình tự. pBluescript chứa MCS với trình tự nhận biết của 21 enzym cắt giới hạn. Bên ngoài vùng MCS là T7, T3 RNA polymerase promoter, có thể sử dụng để tổng hợp RNA invitro. Trình tự của T7, T3 còn có thể sử dụng để thiết kế primer sử dụng cho phƣơng pháp đọc trình tự.
pBluescript chứa trình tự mã hoá cho 131 amino axit của β-galactosidase. Việc phân biệt pBluescript II SK (+/-) hay pBluescript II KS (+/-) phụ thuộc vào cách sắp xếp thứ tự các trình tự nhận biết của các enzym cắt giới hạn trong vùng MCS so với trình tự của T7, T3 RNA polymerase promoter. Ở pBluescript II SK (+/-), trình tự của enzym Kpn I gần với T7 promoter, trình tự của enzym Sac I gần với T3 promoter và ngƣợc lại.
Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MCS của plasmid pBluescript II SK (+/-) 3.2.3 Đoạn DNA
Hai đoạn DNA đƣợc chọn nghiên cứu trong khoá luận này là Đoạn DNA (900bp) của nấm Phytophthora trên cây địa lan Đoạn DNA (223bp) trong vùng Tef của nấm Trichorderma
3.3 Dụng cụ và hóa chất 3.3.1 Dụng cụ thí nghiệm 3.3.1 Dụng cụ thí nghiệm Đĩa petri lớn, nhỏ Ống nghiệm lớn, nhỏ Eppendorf: 1.5ml, 200μl Pipet : 0.5-10 µl; 10 - 100 µl; 100 - 1000 µl
Đầu tip : xanh, vàng, trắng Lọ thủy tinh đƣng hóa chất
Đầu lọc hóa chất : 0.22μm, 0.45μm Bình tam giác : 100ml, 200ml, 500ml Que trang thủy tinh
3.3.2 Các thiết bị máy móc
Tủ cấy vô trùng (micro flow) Bồn ổn nhiệt (water bath) Máy ly tâm (Mikio 22) Tủ định ôn
Máy lắc vi khuẩn Tủ 40C, - 200C, - 800C
Tủ sấy dụng cụ
Thiết bị điện di (Bio - Rad) Máy chụp gel (Bio - Rad) Lò vi sóng (Microway) Nồi hấp (Autoclave - Tomy)
3.3.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn
Môi trƣờng LB lỏng (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua )
Môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, ampicillin)
Môi trƣờng LB agar (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar ) Môi trƣờng LB agar, kháng sinh ampicillin, X-gal, IPTG (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar. Ampicillin, X-gal, IPTG)
3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm
Hóa chất để chuẩn bị tế bào khả nạp : CaCl2 100mM, glycerol 98%.
Hóa chất biến nạp : Ampicillin 100μg/ml, X-gal 20mg/ml, IPTG 300mg/ml.
Hóa chất ly trích plasmid
Dung dịch I (50mM glucose, 25mM Tris-HCl, 10mM EDTA) Dung dịch II (0,2N NaOH, 1% SDS, nƣớc cất)
Dung dịch III (5M Potassium acetate, glacial acetic acid, nƣớc cất) Phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25 : 24 : 1)
Chloroform / isoamyl alcohol (24 :1)
Isopropanol, Ethanol 70 %, TE 1X (pH = 8)
Hóa chất điện divà nhuộm: Loading dye, TAE 0.5X, Ethdium bromide
3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm
Tên enzyme Trình tự nhận
biết Buffer Mã hàng
Nhà sản xuất
BamHI G /GATCC B (10X) Cat. No. 220 612 Roche
EcoRV GAT/ATG B (10X) Cat. No. 667 145 Roche
HindIII A/AGCTT B (10X) Cat. No. 656 313 Roche
DNA T4 ligase NEbuffer 10X Product No. 70005Y usb DNA fragment Klenow T4 reaction buffer Code number M0210S BioLabs
3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn
Vi khuẩn E. coli sau khi xử lí CaCl2 sẽ làm cho màng tế bào trở nên khả nạp giúp cho DNA xâm nhập tế bào E.coli dễ dàng hơn. Giai đoạn sốc nhiệt kế tiếp (420
C trong 45 giây) để kích thích sự chuyển của phân tử plasmid vào trong tế bào. Môi trƣờng dƣỡng chất đƣợc thêm vào sau đó cho phép tế bào hồi phục và plasmid tiến hành sao mã, phiên mã và dịch mã tạo nên các protein tƣơng ứng. Một trong các tính trạng do các gen này qui định đƣợc chọn làm dấu hiệu chọn lọc để phân biệt nhữnng tế bào có tiếp nhận DNA plasmid trong số những tế bào không tiếp nhận DNA plasmid.
Vi khuẩn Ecoli Xử lí CaCl2
Sốc nhiệt ở 420
C trong 45 giây
Cấy lên đĩa
3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra
Sơ đồ 3.3Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra
Vi khuẩn E. coli DH5α + CaCl2 Khả nạp
Plasmid Bluescript II SK (+/-)
Vi khuẩn mang plasmid Bluescript Sốc nhiệt
Chiết tách plasmid
Tinh sạch Đoạn DNA
Cắt plasmid bằng HindIII Blunt - end
Tinh sạch
Phản ứng nối Biến nạp vào khả nạp
Chọn lọc khuẩn lạc màu xanh
Chọn lọc khuẩn lạc màu trắng
Chiết tách plasmid
Cắt plasmid bằng BamHI, HindIII Phản ứng PCR với primer T3, T7
3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E. coli DH5α trên môi trƣờng LB