SDS – PAGE
Sau khi qua các bƣớc ly trích và tinh sạch, ngƣời ta thƣờng kiểm tra lại độ tinh sạch của protein nhờ kỹ thuật điện di. Nhờ kỹ thuật này ta còn có thể xác định trọng lƣợng phân tử và độ tinh sạch của chúng.
Điện di trên gel là tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, protein) bằng cách cho đi qua chất nền là gel trong một điện trƣờng.
Kĩ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS.
Gel polyacrylamide là gel đƣợc tạo thành do sự polymer hóa các phân tử acrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide. Quá trình polymer hóa đƣợc xúc tác bởi hệ thống ammoniumpersulfate (APS); N, N ,N’, N’ - tetramethylenediamine (TEMED).
Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trƣờng và kích thƣớc của lỗ gel.Khả năng phân tách cũng nhƣ giới hạn trọng lƣợng phân tử của các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide : nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thƣớc lớn và ngƣợc lại.
SDS là tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này protein đƣợc xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol.Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2,3,4 đƣợc biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều đƣợc tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thƣớc, những phân tử có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thƣớc nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thƣớc nhất định. Dƣới tác dụng của điện trƣờng các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng và các phân tử tích điện dƣơng sẽ di chuyển về cực âm của điện trƣờng.
Để xác định phân tử lƣợng của một protein, ngƣời ta thƣờng so sánh với một thang phân tử lƣợng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lƣợng phân tử khác nhau đã biết.
Để đƣa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuous gel). Trong phƣơng pháp này gel gồm 2 lớp:
Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên) : các protein trong mẫu đƣợc dồn lại và tạo một lớp băng mỏng.
Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dƣới) : tạo ra các băng protein có trọng lƣợng phân tử, kích thƣớc khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu.
Hai lớp gel này đƣợc phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide và vị trí.
Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định đƣợc những phân tử protein có trọng lƣợng phân tử từ 10.000-200.000 daltons. Những phân tử protein có trọng lƣợng lớn hơn 200.000 daltons thƣờng đƣợc xác định trên gel có nồng độ acrylamide hơn 2,5%.
PHẦN 3:VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP