3.3.3.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
Trình tự 2 mồi được dùng trong phản ứng PCR để khuếch đại vùng tef. Mồi xuôi: 5‟-ATG GGT AAG GA(A/G) GAC AAG AC- 3‟
Mồi ngược: 5‟-GGA (G/A)GT ACC AGT (G/C)AT CAT GTT-3‟ Dụng cụ thí nghiệm:
Máy PCR.
Micropippette, đầu típ, eppendorf các loại. Lò vi sóng.
Bồn điện di .
3.3.3.2 Thực hiện phản ứng
Bảng 3.2 Thành phần một phản ứng PCR
Thành phần Nồng độ đầu Liều lƣợng phản ứng Nồng độ cuối
5X Buffer 5X 10 1X
MgCl2 25 mM 3 1.5 mM
dNTP 25 mM 0,4 0.2 mM
EF1 10 pmol/ l 1 10 pmol/ l
EF2 10 pmol/ l 1 10 pmol/ l
Taq polymerase 5 u/ l 0,2 1.25 u
DNA mẫu 1
Nước Vừa đủ phản ứng 50 l
Chu kì nhiệt của phản ứng PCR
Giai đoạn 1: 95oC trong 3 phút Giai đoạn 2:
Bước 1: 95oC trong 30 giây
Bước 2: 53oC trong 45 giây 30 chu kỳ Bước 3: 72oC trong 45 giây
Giai đoạn 3: 72oC trong 7 phút
3.3.3.3 Đánh giá sản phẩm PCR
Thực hiện tương tự Mục 3.3.2.3.
3.4 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phát hiện GA3 3.4.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
Các dụng cụ dùng trong sắc ký như sau: máy khuấy từ, cá từ, máy đo pH, máy lắc, nồi hấp, giấy lọc, phễu, máy cô quay, bình cầu, bình lắng, ống đong thể
tích 50 ml, pipet các loại, kẹp, kéo, bình ly giải, becher các loại, ống mao quản, bản mỏng, bình tam giác các loại, tủ sấy, đèn UV.
Các hóa chất: chloroform, methanol, acid acetic, acid sulfuric, ethanol, acetone, ethyl acetate, acid chlohydride 0,5N, natri bicarbonate.
Thành phần môi trường ICI:
Glucose 80g MgSO4 5g KH2PO4 1g NH4NO3 5g Nước 1 lít 3.4.2 Phƣơng pháp sản xuất GA3
Chuẩn bị môi trường 20% ICI như Mục 3.4.1. Cho 100 ml môi trường vào mỗi bình tam giác 250 ml. Đem hấp khử trùng ở 121o
C, 1 atm trong 15 phút. Lấy 0,1 ml dịch nấm cho vào bình chứa môi trường.
Lắc 200 vòng/phút ở 28oC trong vòng 7 ngày.
3.4.3 Phƣơng pháp trích GA3
Lọc dịch nấm bằng giấy lọc để loại bỏ sinh khối. Sau đó tiến hành trích mẫu theo qui trình phân tích GA3 của phòng Hóa Lý, Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM.
Dịch nuôi cấy Chỉnh pH=2,5 bằng HCl 0,5N Trích 3 lần bằng ethyl acetate (50 ml) Trích 3 lần với NaHCO3 8% Sắc ký lớp mỏng Pha nước (lớp dưới)
Bỏ
3.4.4 Định tính GA3 bằng TLC
Qui trình định tính GA3 được xây dựng theo phương pháp của MacMillan (1963) trong đó chúng tôi đã thay đổi hệ dung môi giải ly cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm:
Sơ đồ 3.1 Qui trình trích GA3.
Chấm mẫu lên bản sắc ký có chất hấp thụ Silicagel
Ly giải trong hệ dung môi CHCl3:EtOAc:AcOH [60:40:5]
Phun bản bằng EtOH:H2SO4[95:5]
Sấy bản 120oC trong 5 phút
Phát hiện GA3 bằng đèn UV (365nm)
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thu mẫu bệnh lúa von ở Đồng Bằng Sông Cửu Long
Bệnh lúa von do nấm gây ra, có giai đoạn vô tính là Fusarium moniliforme
và giai đoạn hữu tính là Gibberella fujikuroi (B.Tudzynski, 1999). Trong quá trình
sinh trưởng và phát triển nấm tạo ra GAs làm cho cây lúa phát triển chiều cao vì thế gây ra các triệu chứng đặc trưng của bệnh lúa von. Dựa vào triệu chứng đặc trưng này là cây mạ bị nhiễm bệnh vươn dài ra cao hơn hẳn cây lúa bình thường, có bộ lá mỏng màu xanh vàng, thối rễ và bị chết. Ở giai đoạn đẻ nhánh, cây bị bệnh ít nở bụi, gầy và cao, lá đòng có màu xanh vàng dễ nhận biết cao hơn lên hẳn phía trên tầng lá bình thường của ruộng, lóng phát triển dài ra, thường mọc nhiều rễ phụ ở đốt (rễ gió) và có thể thấy lớp phấn trắng phớt hồng bao quanh đốt thân và vị trí xung quanh đốt thân. Chúng tôi đã thu thập được 20 mẫu bệnh thuộc các giống Jasmine 85, OM 2517, OM 2514, OM 4655, OM 2518, OM 4698, OM 504 dòng 2 tại các tỉnh được biểu thị ở Bảng 3.1. Trong nhiều vụ lúa vừa qua, bệnh lúa von đã phát triển nặng trên một số giống lúa như Jasmine 85, OM 2517, IR42 ở An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ, Sóc Trăng, Trà Vinh (http://www.congtyhai.com). Thực tế thu mẫu cho thấy giống lúa Jasmine 85 và OM 2517 bị nhiễm bệnh lúa von nhiều hơn các giống khác (Hình 4.1a và Hình 4.1b). Cả hai ruộng lúa này đều ở Huyện Càng Long Tỉnh Trà Vinh tại thời điểm 01/05/2007 và đều bị nhiễm bệnh lúa von nhưng ở Hình 4.1a là ruộng được trồng với giống OM 4698 (nhiễm ít) còn ruộng ở Hình 4.1b thì được trồng bằng giống OM 2517 (nhiễm nhiều). Vậy để hạn chế lúa bị nhiễm bệnh nên tiến hành các biện pháp phòng trừ sau: gieo cấy các giống lúa ít mẫn cảm với bệnh; không dùng hạt giống từ những hạt bị bệnh; xử lý hạt giống bằng nước nóng 54oC hoặc thuốc hóa học trừ nấm có hiệu quả trong việc phòng trừ
bệnh lúa von (Phạm Văn Biên và ctv., 2003). Ngoài ra, theo S.H.Ou (1985) bào tử nấm
Fusarium moniliforme có thể tồn tại trong đất 4 tháng do đó nên xử lý đất sau khi thu hoạch và trồng cách vụ để hạn chế tối đa sự phát sinh của mầm bệnh.
Ghi chú: các mũi tên chỉ cây lúa nhiễm bệnh lúa von.
4.2 Kết quả phân lập và tách đơn bào tử
Sau 2 – 3 ngày đặt mẫu bệnh (3 mm x 3 mm) trên môi trường WA (môi trường nghèo dinh dưỡng nên loại sự tạp nhiễm trên mẫu bệnh), từ mẫu bệnh xuất hiện sợi nấm mọc lên trên mẫu và lan ra môi trường (Hình 4.2).
Hình 4.1 Ruộng lúa bị nhiễm bệnh lúa von ở Càng Long – Trà Vinh ngày 01/05/2007. (a) giống OM 4698 bị nhiễm nấm F.moniliforme; (b) giống OM 2517 bị nhiễm nấm F.moniliforme.
(a) (b)
Mẫu bệnh
Sợi nấm mọc trên mẫu bệnh
Hình 4.4 Màu khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme trên
môi trƣờng PDA sau 7 ngày cấy.
Dùng que cấy lấy một ít sợi nấm trên mẫu bệnh sang môi trường WA, sau 2 – 3 ngày sợi nấm mọc lan ra môi trường. Tiến hành tách một phần môi trường có sợi nấm sang đĩa môi trường PDA (môi trường để tạo dòng thuần các dòng nấm và dùng để định danh nấm dựa vào hình thái), tiếp tục nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sau 5 – 7 ngày thu được khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme có những đặc điểm (Hình 4.3) như : màu trắng nhạt, mọc tỏa ra theo cấu trúc hình tròn, bề mặt khuẩn lạc xốp kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Trần Tùng (2005).
Theo Lester W. Burgess và ctv (1994), khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme khi được nuôi cấy trên môi trường PDA có màu sắc rất đa dạng như không màu, cam nhạt (bright organe hay pale organe), xám tím (violet grey), tím đậm (dark violet) hoặc đỏ đậm (dark magenta). Trong 20 dòng nấm được phân lập thu được 18 dòng có khuẩn lạc màu cam nhạt và 2 dòng có màu đỏ đậm.
Hình 4.3 Khuẩn lạc nấm F.moniliforme sau 7 ngày cấy.
Để khẳng định mẫu nấm thu được là Fusarium moniliforme tiếp tục xem bào tử dưới kính hiển vi. Kết quả nhận thấy đại bào tử (Hình 4.5) và tiểu bào tử (Hình 4.6).
Quan sát đại bào tử và tiểu bào tử của các dòng nấm được phân lập dưới kính hiển vi ở vật kính 40X chúng tôi ghi nhận được các đặc điểm giống như mô tả của (Vũ Triệu Mân và ctv., 1998): đại bào tử của nấm Fusarium moniliforme thanh mảnh, dài, hai đầu nhọn, hơi cong hình lưỡi liềm hay gần thẳng có một cái móc ở đỉnh và có 3 – 5 vách ngăn và tiểu bào tử có hình trứng dẹt, không có hoặc có một vách ngăn.
Sau khi thu được các dòng nấm có khuẩn lạc thuần, tiến hành tách đơn bào tử với mục đích tạo ra khuẩn lạc đồng nhất về mặt di truyền (Trích Ngô Quang Hưởng, 2006) và hạn chế đột biến trong quá trình nuôi cấy (Paul E. Nelson, 1992). Dựa vào các đặc điểm trên chúng tôi tiến hành tách đơn bào tử theo Mục 3.3.1.3. Và tách thành công đơn bào tử của 20 dòng nấm được phân lập.
4.3 Kết quả nhân sinh khối
Bào tử thu được sau khi tách đơn bào tử sẽ phát triển thành khuẩn lạc. Dùng dao cấy cắt 3 mẫu thạch chứa sinh khối nấm (mỗi mẫu kích thước khoảng 9 mm2
) đĩa petri sang bình tam giác để tăng nhanh sinh khối. Các bình tam giác này chứa môi trường nhân sinh khối và được lắc ở 160 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 C. Nấm
Hình 4.5 Đại bào tử F.moniliforme
(xem ở vật kính 40X).
Hình 4.6 Tiểu bào tử F.moniliforme
được nhân sinh khối trong môi trường lỏng nhằm tạo điều kiện cho khuẩn lạc nấm tiếp xúc với môi trường nhiều hơn từ đó tăng nhanh sinh khối. Sau khoảng 3 – 4 ngày, khi sinh khối đã đạt được lượng cần thiết ta tiến hành thu sinh khối. Vấn đề thường gặp trong giai đoạn này là rất dễ bị nhiễm khuẩn, đặc biệt là trong ngày thứ nhất và thứ hai. Tuy theo dõi từng ngày trong quá trình lắc nhưng do lắc liên tục nên rất khó phát hiện bị nhiễm khuẩn trong khi lắc. Để đảm bảo không bị nhiễm khuẩn, trước khi thu sinh khối ta tiến hành quan sát kỹ dịch lỏng, thông thường mẫu bị nhiễm khuẩn sẽ bị đục trong khi lắc.
4.4 Kết quả ly trích DNA của nấm
Sợi nấm được thu nhận sau khi nhân sinh khối các dòng nấm và được tiến hành ly trích DNA tổng số theo qui trình 1 nêu ở Mục 3.3.2.2. Kết quả ly trích được thể hiện ở Hình 4.7.
Sản phẩm điện di DNA tổng số ly trích theo qui trình 1 có quá nhiều tạp, do đó chúng tôi đã tiến hành ly trích DNA theo qui trình 2 là thay thế bước xử lý phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) bằng chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) thì hạn chế được lượng DNA đứt gãy (Hình 4.8).
Tạp
Hình 4.7 Kết quả ly trích DNA theo qui trình 1.
Ghi chú: (1) FM1; (2) FM2; (3) FM3; (4) FM4; (5) FM5; (6) FM6; (7) FM7; (8) FM8; (9) FM9; (10) FM10; (11) FM11; (12) FM12; (13) FM13; (14) FM14; (15)
FM15; (16) FM16; (17) FM 17; (18) FM18; (19) FM19; (20) FM20.
Thời gian ở các lần ly tâm của qui trình Lee và Taylor cải tiến 10 – 15 phút do đó đã tăng thời gian để phá hủy lớp vỏ tế bào, lớp màng nhân, loại bỏ protein và cũng giúp cho sự phân lớp giữa phần dịch tế bào chứa DNA, lớp xác tế bào và protein tốt hơn vì vậy loại bỏ được nhiều tạp trong quá trình ly trích mặc dù qui trình này không dùng proteinase K để loại bỏ các protein và RNase để loại bỏ RNA. Bên cạnh đó, phenol có thể làm đứt gãy DNA. Do đó khi tiến hành ly trích với qui trình 2 chúng tôi thu được kết quả tối ưu hơn qui trình 1. Theo Hình 4.8, DNA của các dòng FM12, FM13, FM14, FM17, FM19 có lượng tạp rất ít nên có thể tiến hành
15
12 13 14 16 17 18 19 20
DNA tổng số
Phần tạp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Hình 4.8 Kết quả ly trích DNA của 20 dòng nấm Fusarium moniliforme theo qui trình 2.
chạy PCR sau khi pha loãng 10 lần bằng TE 1X hoặc nước khử ion. DNA của các dòng nấm còn lại do lượng tạp tương đối nhiều nên phải tiến hành tinh sạch lại.
4.5 Kết quả PCR
Theo David và ctv (2004) một trong những trở ngại lớn khi nghiên cứu
Fusarium là việc định danh loài dựa vào hình thái, độc tố hoặc khả năng gây bệnh vì những đặc điểm phân chia loài dựa vào hình thái chưa rõ ràng đồng thời cũng có nhiều biến đổi và đột biến trong quá trình nuôi cấy. Để giải quyết vấn đề này các tác giả trên đã tạo ra Fusarium ID.v.1.0 – dữ liệu trình tự DNA của vùng tef để xác định nhanh và chính xác các nấm tạo độc tố trichothecene loại B và phức hệ loài
Gibberella fujikuroi; Fusarium oxysporum; Fusarium solani.
Vùng gen tef có thể phân biệt được giữa các nhóm với nhau hay giữa loài cùng nhóm. Vùng tef được nghiên cứu nhiều hơn do chứa trình tự DNA đặc trưng cho từng nhóm loài (Trích Lại Hà Tố Hoa, 2006). Đặc biệt đối với Fusarium vùng gen tef mã hóa những protein thiết yếu trong quá trình dịch mã và rất hữu ích để xác định nguồn gốc phát sinh loài. Ngoài ra gen này là bản sao đơn bền vững ở
Fusarium và nó cho mức độ đa hình cao ở các loài có quan hệ gần gũi từ đó tef trở thành công cụ định danh Fusarium dựa trên locus đơn. Trên cơ sở đó chúng tôi sử dụng cặp mồi ef1 và ef2 được thiết kế bởi O‟Donnell và ctv (1998) để khuếch đại vùng gen tef của 20 dòng nấm Fusarium spp. gây bệnh lúa von ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Kết quả thu được sản phẩm khuếch đại của 14 dòng nấm có kích thước gần bằng 700 bp rõ và ít tạp. Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của David và ctv (2004). Bên cạnh đó kết quả PCR (Hình 4.9) cũng cho thấy sản phẩm PCR của các dòng nấm Fusarium moniliforme được thu thập trên các giống lúa ở các tỉnh ĐBSCL đều có kích thước của vùng tef bằng nhau. Hạn chế của đề tài là chúng tôi chưa tiến hành PCR hết tất cả các dòng nấm được phân lập.
4.6 Kết quả định tính GA3 bằng TLC
GAs là nhóm hormon thực vật quan trọng thứ hai sau nhóm auxin do những ứng dụng đa dạng của nó đối với sự sinh trưởng, phát triển và sinh sản của cây trồng như kích thích sự kéo dài của đốt, phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của hạt và xác định phái tính của hoa (Lincoln Taiz và ctv., 2002). Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện được hơn 136 loại giberelins tiết ra từ vi khuẩn, nấm và thực vật (http://www.plant-hormones.info). Trong đó, nấm Gibberella fujikuroi gây bệnh lúa von sản xuất nhiều GA3.Vì vậy chúng tôi tiến hành nuôi 20 dòng nấm Fusarium moniliforme được phân lập trên môi trường sản xuất GA3 – 20% ICI trong 7 ngày trên máy lắc 200 vòng/phút/28oC (Stefan Malonek và ctv., 2005). Sau đó tiến hành trích GA3 như Mục 3.4.3 rồi thực hiện TLC theo Mục 3.4.4.
Kết quả nuôi 20 dòng nấm Fusarium moniliforme trong môi trường 20% ICI tốt, không bị nhiễm trong quá trình nuôi cấy. Để kiểm tra giới hạn phát hiện GA3 của chuẩn chúng tôi tiến hành TLC chất chuẩn ở các nồng độ 1, 5, 10, 50 và 100 ppm. Kết quả các chuẩn ở nồng độ 1 và 5 ppm thấy không hiện vết khi quan sát dưới đèn UV, còn các chuẩn 10 và 50 ppm thì hiện vết mờ vì thế chúng tôi chọn chuẩn 100 ppm để tiến hành cùng với mẫu.
Hình 4.9 Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại từ DNA của các dòng
Fusarium moniliforme bằng cặp primer ef1-ef2. (1) DNA được khuếch đại từ dòng nấm FM1; (2) FM2; (3) FM3; (4) FM4; (5) FM5; (6) FM7; (7) FM8; (M) ladder; (8) FM9; (9) FM11; (10) FM12; (11) FM14;(12) FM15; (13) FM16; (14) FM18.
Trong 20 mẫu nấm sau khi nuôi cấy, trích GA3 và tiến hành TLC trên hệ dung môi chloroform: ethyl acetate: acid acetic (60:40:5) chúng tôi nghi ngờ 3 dòng nấm FM2, FM5 và FM15 có thể tạo ra GA3 trong môi trường nuôi cấy (Hình 4.10). Các dung dịch nuôi cấy 17 dòng còn lại không hiện vết tại vị trí có Rf tương đương với chuẩn.
Theo Hình 4.10 nhận thấy vết đầu tiên trên bản TLC từ dưới lên của dung dịch nuôi cấy 3 dòng nấm FM2, FM5 và FM15 tương ứng với vị trí số 1, 2, 4 có giá trị Rf tương đương với vết GA3 chuẩn 100 ppm ở vị trí số 3 (Rf=0,12).
Ghi chú: (1); (2); (4) tương ứng là dung dịch nuôi cấy các dòng nấm FM2, FM5 và FM15. (3) chuẩn GA3 100 ppm.
Tuy nhiên chúng tôi tiến hành trên hệ dung môi chloroform:methanol:acid acetic (85:15:5) (Đỗ Thị Di Thiện, 2005) phân cực hơn hệ dung môi cũ nhằm khẳng định Rf của các vết từ dung dịch nấm có tương đương với vết chuẩn GA3 hay không. Kết quả thu được Rf của 3 mẫu thấp hơn Rf của chất chuẩn. Ngoài ra dựa vào Hình 4.10, các vết khác ở các mẫu có thể là các giberelins khác do nấm tiết ra trong quá trình nuôi cấy. Thật vậy, theo tác giả Nguyễn Văn Uyển (1989), dung dịch nuôi cấy một số chủng nấm lúa von Gibberella fujikuroi đã phát hiện sự tồn tại của 25 loại giberelin. Từ những kết quả trên nhận thấy qui trình thực hiện trên 20 dòng nấm không hiệu quả do một số nguyên nhân sau: điều kiện nuôi cấy nấm, qui trình trích GA3 chưa tối ưu và nồng độ GA3 trong dung dịch nuôi cấy nấm quá thấp.
Hình 4.10 Kết quả TLC dịch nấm sau khi nuôi cấy các dòng nấm F.moniliforme
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Đã phân lập và tách đơn bào tử được 20 dòng nấm Fusarium moniliforme