Song song với việc nuơi cấy vi khuẩn Lxx, chúng tơi cũng tiến hành chạy PCR trực tiếp trên dịch chiết của cây mía bị bệnh. Sau nhiều lần tiến hành thí nghiệm, thay đổi quy trình và sử dụng các chất bổ sung khác nhau vào phản ứng PCR, nhƣng kết quả PCR dựa vào cặp mồi của Stevens Brumbley (2003) đều khơng đạt đƣợc kết quả mong đợi.
- Kết quả thí nghiệm 1: PCR theo protocol của Stevens Brumbley (2003).
Kết quả điện di: Khơng cĩ sản phẩm trên gel điện di.
Nhận xét: Nguồn mẫu DNA đƣợc chuẩn bị theo quy trình của Stevens Brumbley (2003) để chạy phản ứng PCR. Primer đƣợc đặt mới tại cơng ty Biorad với trình tự đƣợc blast trên NCBI cĩ kết quả cho bắt cặp đặc hiệu với vi khuẩn Lxx trên ngân hàng gen. Tuy nhiên kết quả điện di khơng cĩ thì
đƣa vào chƣa đƣợc biến tính tốt.
- Thí nghiệm 2: Thay đổi cách chuẩn bị mẫu. Khảo sát hiệu quả của hai phƣơng
pháp chuẩn bị mẫu: Biến tính bằng nhiệt và li trích DNA vi khuẩn Lxx. Chạy
PCR theo thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt nhƣ ở thí nghiệm 1.
Mẫu đƣợc chuẩn bị và đem đi đo OD, tính kết quả lƣợng DNA cĩ trong mẫu và thêm vào trong thành phần phản ứng PCR với nồng độ thƣờng dùng là 0,5 μM. Kết quả: khơng cĩ băng DNA trên gel điện di. Nhận xét: Do OD khơng cĩ tác dụng trong trƣờng hợp này vì dịch chiết nƣớc mía cĩ chứa nhiều nhân tố ức chế nên lƣợng DNA đo đƣợc khơng chính xác với thực tế DNA mẫu vi khuẩn trong mẫu. Tăng lƣợng DNA mẫu đƣa vào phản ứng PCR lên 1,5 và 2 lần cũng khơng cho kết quả vì điều này cũng đồng nghĩa với việc tăng các nhân tố ức chế phản ứng PCR.
Hút DNA từ lớp trên của dịch biến tính đem chạy PCR. Tăng lƣợng DNA mẫu đƣa vào phản ứng với nồng độ gấp 1,5 lần, 2 lần. Kết quả: khơng cĩ băng DNA trên gel điện di. Nhận xét: DNA sau khi biến tính sẽ nằm ở lớp trên dung dịch vì vậy chúng tơi sử dụng lớp này chạy PCR nhằm thu lƣợng DNA sạch, Tuy nhiên kết quả PCR khơng cho sản phẩm khuyếch đại thì cĩ thể là do biến tính Lxx. Cĩ lẽ trong quá trình biến tính vi khuẩn bằng cách gia nhiệt, thành tế bào vi khuẩn bị phá vỡ và DNA vi khuẩn Lxx thốt ra ngồi, tuy nhiên quá
trình này cũng giải phĩng ra các enzym phân hủy hoặc làm hƣ hỏng DNA vốn tồn tại trong tế bào. Do vậy chúng tơi thử nghiệm ly trích DNA vi khuẩn từ dịch chiết nƣớc mía.
Thực hiện lọc mẫu dịch vi khuẩn ở màng lọc 0,4 μm; chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR, tƣơng tự nhƣ quy trình của Stevens Brumbley (2003). Nhận xét: Dùng màng lọc 0,4 μm lọc Lxx và kiểm tra vi khuẩn cĩ qua lỗ lọc khơng bằng cách quan sát dƣới kính hiển vi. Kết quả quan sát dƣới kính hiển vi kiểm tra khơng thấy cĩ sự hiện diện của vi khuẩn Lxx trong dịch lọc. Chúng tơi nhận
định rằng cĩ thể màng lọc 0,4 μm cĩ kích thƣớc nhỏ nên vi khuẩn Lxx khơng qua đƣợc, hoặc cĩ qua nhƣng ít và khơng thể quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi. Do vậy chúng tơi vẫn tiếp tục thực hiện cách biến tính mẫu nhƣ quy trình của Stevens Brumbley và đem do OD sản phẩm, hút DNA mẫu ở lớp trên dịch biến tính để chạy PCR nhƣng vẫn khơng đạt đƣợc kết quả. Kết luận: Khơng
thể loại bỏ đƣợc các nhân tố ức chế phản ứng PCR trực tiếp trong dịch chiết nƣớc mía bằng cách ly tâm đƣợc.
Li trích vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía theo quy trình ly trích vi khuẩn thơng thƣờng. Kết quả: Khơng cĩ băng DNA vi khuẩn trên gel điện di sau li trích. Nhận xét: Cĩ thể do lƣợng vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía cĩ ít nên thực hiện li trích DNA khơng cĩ kết quả.
- Thí nghiệm 3: Khảo sát hiệu quả sử dụng của PVP trong PCR trực tiếp từ dịch
chiết nƣớc mía.
Kết quả: khơng cĩ sản phẩm PCR đích.
Nhận xét: Tăng hàm lƣợng PVP vào phản ứng nhằm mục đích tăng cƣờng khả năng khử các nhân tố ức chế phản ứng PCR, tuy nhiên cĩ lẽ khi nồng độ PVP cao thì nĩ cũng quay lại ức chế phản ứng PCR do đĩ chúng tơi khơng tăng nồng độ PVP trong các thí nghiệm tiếp theo nữa. Do vậy chúng tơi tiếp tục làm thí nghiệm theo hai hƣớng. Thứ nhất là giữ nguyên cách chuẩn bị mẫu DNA cho PCR theo Stevens Brumbley (2003) và thay đổi quy trình phản ứng. Thứ hai là thay đổi quy trình chuẩn bị mẫu DNA cho PCR.
- Thí nghiệm 4: Chuẩn bị mẫu theo quy trình của Stevens Brumbley. Khảo sát ảnh
hƣởng của các thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt.
Kết quả thí nghiệm: Khơng cĩ sản phẩm trên gel điện di.
Tĩm lại, PCR là một hệ thống tƣơng thích các thành phần hĩa chất và chu trình nhiệt. Nhiều trƣờng hợp phản ứng PCR đƣợc thực hiện từ dịch DNA mẫu ly trích với mồi chuyên biệt nhƣng vẫn khơng ra kết quả. Vì vậy PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc mía là một vấn đề rất khĩ thực hiện vì nguồn mẫu ban đầu là dịch chiết nƣớc mía khơng sạch, cĩ chứa nhiều nhân tố ức chế phản ứng PCR. Kết quả điện di sản phẩm sau các lần chạy PCR mà khơng cĩ băng DNA đích trên gel điện di thì cĩ thể là do rất nhiều nguyên nhân:
- Cĩ thể là nguồn DNA mẫu đƣa vào trong phản ứng PCR khơng tinh sạch. Chúng
tơi tiến hành ở đây là do trong dịch chiết cĩ quá nhiều chất lơ lửng, ức chế phản ứng PCR. Nguồn mẫu dịch chiết mà chúng tơi dùng để chạy phản ứng PCR đƣợc thu từ những cây cĩ triệu chứng điển hình ngồi đồng ruộng, kết hợp với kiểm tra quan sát sự xuất hiện vi khuẩn Lxx trong dịch chiết mía dƣới kính hiển vi và dƣơng tính khi nhuộm STM. Tuy nhiên mặc dù đã xác định đƣợc lƣợng mẫu đƣa
vào là cĩ vi khuẩn đích nhƣng cịn quá nhiều yếu tố khơng thể kiểm sốt đƣợc nhƣ các chất ức chế phản ứng cĩ trong dịch chiết nƣớc mía, lƣợng mẫu DNA thích hợp đƣa vào phản ứng.
- Cĩ thể hĩa chất mà chúng tơi sử dụng sau nhiều lần thực hiện phản ứng đã làm
đơng lạnh và rã đơng nhiều lần dẫn đến sự mất hoạt tính của hĩa chất đặc biệt là
Taq DNA polymerase và primer.
- Mặt khác các máy PCR khác nhau cũng cho kết quả khác nhau. Hiện TTPT cĩ 3
loại máy PCR và mỗi máy cĩ một chế độ lên xuống nhiệt độ theo chu kỳ nhiệt khác nhau (nhanh hay chậm) do vậy đây cũng là một nguyên nhân khơng thể loại trừ. Tuy nhiên sau khi thực hiện PCR luân phiên trên cả 3 loại máy vẫn khơng cĩ kết quả.
Phần 5. KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
- Các giống mía đƣợc khảo sát khơng bị nhiễm SCMV.
- Tỉ lệ mơ cây khơng bị nhiễm bệnh cằn mía gốc trên các giống mía khảo sát trong phƣơng pháp nhuộm STM tại TTNCMĐ là 70,5%, tại nơng trƣờng Thọ vực là 75,18%.
- Nuơi cấy phân lập vi khuẩn Lxx chƣa thu đƣợc khuẩn lạc.
- Phát hiện vi khuẩn Lxx dựa vào kỹ thuật PCR trực tiếp dịch chiết nƣớc mía
chƣa đạt đƣợc kết quả mong muốn.
5.2. Đề nghị
- Tiến hành điều tra khảo sát tình hình bệnh khảm lá mía và cằn mía gốc trên nhiều giống mía ở các giai đoạn tăng trƣởng khác nhau, và thực hiện tại các vùng mía lận cận để cĩ cái nhìn tổng quát và chính xác hơn về tình hình diễn biến của bệnh tại 2 khu vực này. Đặc biệt là đối với bệnh cằn mía gốc, cần tiến hành bố trí thí nghiệm trên nhiều giống khác nhau đối chứng với giống khơng bị bệnh, để cuối cùng cĩ con số thống kê chính xác về tình hình và mức độ gây hại của bệnh hiện nay, từ đĩ cĩ những khuyến cáo thích hợp trong việc phịng trừ và kiểm sốt bệnh.
- Qua quá trình tìm hiểu về bệnh cùng với sự hỗ trợ về kiến thức của GS. Stevens
Brumbley (Australia), ngƣời đã cĩ kinh nghiệm nghiên cứu lâu năm về bệnh cằn mía gốc và vi khuẩn Lxx, chúng tơi xin đề nghị về quy trình nuơi cấy thu khuẩn lạc vi khuẩn Lxx, cũng nhƣ quy trình PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc
mía nhƣ sau trong các thí nghiệm tiếp theo nhƣ sau:
Quy trình nuơi cấy vi khuẩn Lxx
Xác định triệu chứng ngồi đồng ruộng.
Xác định cây nhiễm bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp nhuộm STM.
Thu dịch chiết (tiến hành vơ trùng), kiểm tra sự hiện diện của Lxx dƣới
kính hiển vi điện tử hay đối pha (Phụ lục 1).
Nuơi cấy vi khuẩn trên mơi trƣờng MCS cĩ bổ sung các thành phần theo
Tăng sinh trong mơi trƣờng lỏng S8 để thu sinh khối (Thành phần mơi trƣờng nuơi cấy cho ở Bảng phụ lục 2).
Quy trình PCR phát hiện vi khuẩn Lxx:
Nuơi cấy thu sinh khối vi khuẩn Lxx, thực hiện li trích DNA vi khuẩn Lxx
theo quy trình cho ở Phụ lục 3.
Thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn Lxx
Sau khi ổn định quy trình rồi thì tiến hành PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Bộ nơng nghiệp và phát triển nơng thơn, 8/2006. Báo cáo tổng kết mía đường năm
2005-2006.
2. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nơng
nghiệp.
3. Đỗ Ngọc Diệp, 2002. Nghiên cứu sâu đục thân hại mía và biện pháp phịng trừ ở
vùng Đơng Nam Bộ. Luận án tiến sỹ, Đại học Nơng Nghiệp I, Hà Nội.
4. Hà Đình Tuấn, 2004. Điều tra thành phần hại mía trên một số giống mới nhập nội
và khảo sát diễn biến bệnh hại quan trọng ở vùng mía nguyên liệu vùng Đơng Nam Bộ. Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp. Đại học Nơng Lâm TP. Hồ Chí
Minh.
5. Lê Song Dự, Nguyễn Thị Quí Mùi, 1997. Cây mía. Nhà xuất bản Nơng nghiệp
Tp. Hồ Chí Minh.
6. Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999. Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng. Nhà
xuất bản Giáo dục.
7. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu cơng nghệ sinh
học. Nhà xuất bản Nơng nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Huy Ƣớc, 1994. Kỹ thuật trồng mía. Nhà xuất bản Nơng nghiệp.
9. Nguyễn Văn Tuất, 2002. Kỹ thuật chẩn đốn và giám định bệnh hại cây trồng.
Nhà xuất bản Nơng nghiệp.
10. Phạm Văn Ty, 2001. Miễn dịch học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội.
11. Phan Gia Tân, 1990. Cây mía. Tủ sách ĐH Nơng Lâm.
12. Trƣơng Lê Bạch Liên, 2005. Điều tra và phát hiện bệnh khảm lá (Sugarcane Mosaic Virus) trên cây mía (Sacccharum spp) bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng kỹ thuật RT-PCR. Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Nơng học, Đại học Nơng
Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam.
13. Vũ Triệu Mân, 2003. Chẩn đốn bệnh hại thực vật. Nhà xuất bản Nơng nghiệp.
TIẾNG NƢỚC NGỒI
14. Andreas Westphal and T. Eril Mirkov, 2003. Need for improved detection of
Ratoon stunting disease in Sugarcane in South Texas. Phytopathology 7: p 133 -
15. Alfred. Hercules, 2000. Aurum Total RNA Mini Kit Instruction Manual Bio-Rad Laboratories, p 26-27.
16. Chemicon International, Inc - 28820 Single Oak Drive - Temecula, CA 92590,
Introduction to Antibodies - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
<http://www.chemicon.com/resource/ANT101/a2C.asp>
17. Damann. K.E, Jr. 1988. Alkaline-induced metaxylem autofluorescence: a
diagnostic symptom of ratoon stunting disease of sugarcane. Phytopathology 78: p 233 - 236.
18. Fegan, 1999. Sensitive and specific detection of Clavibacter xyli subsp. xyli, causal agent of ratoo stunting disease os sugarcane , with a polymerase chain reaction-based assay. Phytopathology, p 33 - 36.
19. John R. Crowther, 2001, The Elisa Guidebook – Volume 149, p 12 – 34.
20. Gillaspie Jr., A.G. Davis, M.J. (1992): Ratoonstunting disease of sugarcane. In
Plant disease of International Importance. Disease of sugar, Forestand Plantation Crops, vol4 (A.N. Mukhopadhyay,J. Kamar, H.S. Chaube, U.S.Singh, eds). EnglewoodCliffs: New Jersey, Prentice Hall, p 41 – 61.
21. G.P. Rao, A. Salem Saumtally, Phillippe Rott. (2004). Sugarcane pathology.
Volume III: Bacteria and nematode diseases, p 1 – 225.
22. Hoy J. W; Grisham M. P. and Damann K.E, 1999. Spread and increase of ratoon
stunting disease and comparison of disease detection methods. In Plant disease.
23. Koike H, and Gillaspie A.G, 1989. Mosaic. In: Diseases of Sugarcane: Major diseases, (Edited by C. Recaud, B. T. Egan, A.G. Gillaspie, C. G. Hughes).
International Society of Sugarcane Technologist, p 301-322.
24. P. Taylor and Stevens Brumbley, 2003. Development of PCR –based markers for
detection of Leifsonia xyli subsp. xyli in fibrovascular fluid of infected sugarcane
plants. CSIRO publishing.
25. Y Pan, 1998. A polymerase chain reaction protocol for detection of Clavibacter xyli subsp xyli, the causal bacterium of sugarcane ratoon stunting.
Phytopathology: p 1 – 8.
26. Biowave vol.6 No.23 2004, tomato spotted wilt virus.
<www.bric.postech.ac.kr/webzine/content/review/virology/2005/v7n12/pv0616.pdf >
27. G.A. Dafalla, Plant Pathology Centre, Faculty of Agricultural Sciences,University
of Gezira, Wad Medani, Sudan.
<www.iita.org/info/virology/pdf_files/18-24.pdf>
28. Introduction to Microbiology: Virus Genomes, 2005. <http://www-micro.msb.le.ac.uk/109/Introduction.html>
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Qui trình thu dịch chiết nƣớc mía.
(Quy trình đƣợc đƣa ra bởi Stevens Brumbley - 2006)
1. Cắt hết lá của thân bị nhiễm bệnh.
- Phụ thuộc vào chiều dài của mắt mía mà cắt đoạn thân ra cĩ chứa 3 - 4 mắt mía - Vì nồng độ vi khuẩn cao nhất ở dƣới thân cho nên lấy phần thân ở sát gốc mía.
2. Rửa thân bằng bàn chải và lau cho khơ bằng giấy lau.
3. Rửa sạch bằng nƣớc.
4. Ngâm thân mía vào trong dung dịch thuốc tẩy 10 % trong 10 phút.
5. Rửa sach dƣới vịi nƣớc máy.
6. Khử trùng thân mía bằng cồn 70 % và đốt để cho hết cồn cịn dƣ.
7. Cắt một đoạn thân mía ra và khử trùng đoạn thân này.
8. Dùng bơm đẩy khí từ một đầu và thu dịch chiết ở đầu kia bằng eppendorf
vơ trùng.
9. Đổ dịch chiết trên vào mơi trƣờng nuơi cấy MSC. Kiểm tra mơi trƣờng
Phụ lục 2: Thành phần mơi trƣờng nuơi cấy vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli
(Quy trình đƣợc đƣa ra bởi Stevens Brumbley - 2006)
MƠI TRƢỜNG MSC ( CHO 1L MƠI TRƢỜNG)
Thành phần hấp vơ trùng:
Corn meal agar = 17 g
Bacto-agar = 4 g Bacto-peptone = 8 g MgSO47H2O = 0.2 g K2HPO4 (0.1 M ) = 13 ml KH2PO4 (0.1 M ) = 87 ml H2O = 800 ml Thành phần lọc Glucose = 2 g Cysteine = 0.5 g
Bovine serum albumin = 2 g H2O = 100 ml
Bovine hemin chloride = 30 ml
Hịa tan các thành phần hấp trong nƣớc và chỉnh về pH = 7,5 với 5 N NaOH. Hấp vơ trùng. Hịa tan các thành phần lọc vào trong nƣớc và thêm vào mơi trƣờng đƣợc hấp khi
chúng ở 55OC bằng một màng lọc vơ trùng 0.22 m. MƠI TRƢỜNG LỎNG S8 Thành phần hấp vơ trùng Bacto - Soytone = 8 g Hemin chloride = 15 ml MgSO4 .7H2O = 0.2 g K2HPO4 = 0.35 g KH2PO4 = 1.1 g H2O = 885 ml Thành phần lọc: Glucose = 2 g Cysteine = 0.5 g
Bovine serum albumin = 2 g H2O = 100 ml
1) Hịa tan tất cả các thành phần trong nƣớc và chỉnh về pH 6,6 bằng NaOH 5N. 2) Hấp vơ trùng và trữ ở nhiệt độ phịng đến khi thêm các thành phần lọc vơ trùng vào.
Phụ lục 3: Quy trình li trích DNA vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli
(Quy trình đƣợc đƣa ra bởi Stevens Brumbley - 2006)
Quy trình gồm 14 bƣớc nhƣ sau:
1) Nuơi Lxx trong 50 ml mơi trƣờng lỏng S8. 2) Thu tế bào (ly tâm 6000 vịng trong 10 phút).
3) Huyền phù tế bào trong 2 ml lysis buffer (50 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA). 4) Ủ ở 37OC trong 30 phút.
5) Thêm 1/10 thể tích SDS vào để đạt nồng độ 1% SDS. 6) Thêm proteinase K đến nồng độ cuối cùng là 50 μg/ml. 7) Ủ ở 50 - 55OC trong 4 giờ.
8) Ly trích với phenol trung tính: chloroform : isoamyl alcohol cho đến khi bề mặt đƣợc rửa sạch.
9) Thêm ethanol lạnh vào với thể tích tăng 2 lần nhằm làm kết tủa acid nucleic. 10) Thu DNA bằng pipet, rửa cẩn thận bằng cồn 70%.
11) Xử lí bằng Rnase.
12) Tiếp tục thêm phenol : chloroform để kết tủa ethanol. 13) Thu DNA bằng pipet và rửa bằng cồn 70%.