1. MỞ ĐẦU
2.6. PHƢƠNG PHÁP VI CHIẾT XUẤT TRÊN PHA RẮN (SPME)
2.6.1. Nguyên tắc [33]
SPME là 1 phƣơng pháp chiết xuất không cần sử dụng dung môi, đƣợc phát minh bởi Pawliszyn và cộng sự từ năm 1989. Phƣơng pháp này dựa trên cơ chế hấp phụ các chất hữu cơ cần phân tích từ pha nƣớc hoặc pha khí lên sợi silica đƣợc phủ các chất hấp phụ thích hợp nhƣ polydimethylsiloxan (PDMS), PDMS/DVB (divinyl benzen), polyacrylat…thông qua tác động phân chia giữa những chất đƣợc hấp phụ và hỗn hợp mẫu. Quá trình hấp phụ diễn ra khi nhúng sợi chiết vào mẫu lỏng hay khi phơi sợi chiết ra môi trƣờng phía trên mẫu lỏng hay rắn. Các hợp chất bám trên sợi silica sẽ đƣợc giải hấp phụ trực tiếp vào buồng hóa hơi của thiết bị sắc ký khí.
2.6.2. Đặc điểm [33]
Kỹ thuật này kết hợp các giai đoạn chuẩn bị mẫu, chiết xuất, cô cạn mẫu thành 1 bƣớc đơn giản, không cần sử dụng dung môi. Các chất cần phân tích sẽ đƣợc chiết xuất và làm giàu trực tiếp vào sợi chiết. Phƣơng pháp này giúp tiết kiệm thời gian chuẩn bị mẫu và lƣợng dung môi sử dụng, và có thể cải thiện đƣợc giới hạn dò. Thuận lợi chính của phƣơng pháp là khả năng phân tích tốt, đơn giản, giá thành thấp. Sản
phẩm thu đƣợc từ phƣơng pháp SPME tƣơng đối sạch và cô đặc, khả năng ứng dụng MS cao.
Kỹ thuật SPME thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với GC và GC/MS. Kỹ thuật này đã đƣợc áp dụng thành công trong việc phân tích nhiều thành phần khác nhau, đặc biệt, trong quá trình chiết xuất những thành phần hữu cơ bay hơi có trong những mẫu phân tích môi trƣờng, sinh học, thực phẩm, dƣợc phẩm. Sợi chiết dùng trong kỹ thuật SPME có thể đƣợc đƣa trực tiếp vào hệ thống HPLC và LC/MS để phân tích những thành phần bay hơi kém hay không bền nhiệt không thể thực hiện trên thiết bị GC hay GC/MS.
Thời gian chiết xuất phụ thuộc vào các yếu tố: loại sợi chiết sử dụng, kích thƣớc mẫu, bề dày lớp polymer. Sử dụng sợi chiết có lớp polymer càng dày thì thời gian chiết xuất càng dài, nhƣng hệ số lặp lại càng cao. Thời gian chiết xuất không phụ thuộc nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu. Thông thƣờng, lớp film có bề dày mỏng nhất ở mức độ có thể chấp nhận đƣợc thƣờng đƣợc sử dụng để giảm thời gian chiết xuất.
2.6.3. Dụng cụ sử dụng cho kỹ thuật SPME [33]
Hình 2.6. Cấu tạo sợi chiết dùng trong kỹ thuật SPME
Sợi chiết đƣợc sử dụng trong kỹ thuật SPME là một đoạn sợi quang học có chứa silica biến tính, ngắn và mỏng (dài khoảng 1 cm, đƣờng kính ngoài cỡ 0,11 mm), đƣợc bao phủ bên ngoài bởi một lớp polyme mỏng (ví dụ polydimethylsiloxane) (hình
2.6). Sợi chiết này khá ổn định cả ở nhiệt độ cao và có cấu tạo hóa học tƣơng nhƣ phía bên trong của cột mao quản silica biến tính sử dụng trong phƣơng pháp sắc ký khí. Sợi chiết đƣợc gắn với một cần kim loại, tất cả đƣợc đặt trong ống kim loại bảo vệ. Để thuận tiện khi sử dụng, toàn bộ hệ sợi chiết và các bộ phận phụ trợ đƣợc bố trí theo kiểu xyranh (hình 2.7).
Hình 2.7. Dụng cụ thực hiện kỹ thuật SPME
Nhiều loại pha tĩnh tẩm cho sợi chiết đƣợc nghiên cứu với mục đích chiết các nhóm chất khác nhau. Giống nhƣ qui tắc khi lựa chọn cột sắc ký khí “các chất giống nhau dễ hòa tan trong nhau”, pha tĩnh tẩm sợi chiết cũng đƣợc lựa chọn trên cơ sở độ chọn lọc đối với các chất cần phân tích đã định và khả năng bay hơi của những chất này. Các pha tĩnh không phân cực (ví dụ: polymethylsiloxan) lƣu giữ hydrocacbon rất tốt. Ngƣợc lại, pha tĩnh phân cực (nhƣ polyacrylat và cacbowax) lại chiết đƣợc các hợp chất phân cực nhƣ phenol, acid cacboxylic rất hiệu quả. Ái lực của pha tĩnh đối với chất cần phân tích có tính chất quyết định trong việc lấy mẫu theo SPME vì cả nền mẫu và pha tĩnh đều cạnh tranh trong tƣơng tác với chất phân tích. Ví dụ, một pha tĩnh đƣợc lựa chọn để chiết các chất phân cực ra khỏi nƣớc phải có ái lực với chất phân tích
mạnh hơn ái lực của nƣớc với chất đó thì mới có thể thực hiện đƣợc quá trình chiết theo yêu cầu.
2.6.4. Các bƣớc thực hiện trong kỹ thuật vi chiết xuất trên pha rắn [33]
Kỹ thuật chiết SPME gồm 2 giai đoạn: (1) phân bố chất phân tích giữa mẫu và pha tĩnh của sợi chiết, (2) chất phân tích đã làm giàu đƣợc giải hấp từ pha tĩnh của sợi chiết và chuyển vào thiết bị phân tích.
Hình 2.8. Các kỹ thuật chiết dùng trong phƣơng pháp SPME
Để thực hiện quá trình chiết, mẫu nƣớc chứa chất hữu cơ hoặc mẫu rắn chứa chất hữu cơ dễ bay hơi cần phân tích đƣợc đặt trong lọ, đóng kín bằng nút có septum. Khi lấy mẫu, ống kim loại bảo vệ chứa sợi chiết SPME đâm xuyên qua septum, sau đó pittông sẽ đẩy sợi chiết lộ ra khỏi ống kim loại bảo vệ. Sợi chiết đƣợc nhúng vào mẫu lỏng hoặc nằm trong không gian hơi phía trên pha mẫu (headspace) (hình 2.8).
Chất phân tích đƣợc chiết từ mẫu vào pha tĩnh của sợi chiết. Sau thời gian hấp phụ, sợi chiết đƣợc kéo vào trong lòng ống bảo vệ, rồi rút ra khỏi lọ đựng mẫu. Sau đó ống bảo vệ chứa sợi chiết đƣợc đƣa vào bộ phận bơm mẫu của sắc ký khí hoặc sắc ký lỏng cao áp, pittông lại đẩy sợi chiết ra khỏi ống bảo vệ. Lúc này, sợi chiết tiếp xúc với môi trƣờng nhiệt độ cao trong bộ phận bơm mẫu của GC, các chất phân tích đã làm giàu đƣợc giải hấp nhiệt và chuyển vào cột sắc ký khí. Trong HPLC, dung môi đƣợc sử dụng để giải hấp chất phân tích khỏi sợi chiết. Sau các quá trình giải hấp này, sợi chiết lại đƣợc kéo vào lòng ống bảo vệ và rút ra khỏi bộ phận bơm mẫu.
2.6.5. Ứng dụng phƣơng pháp SPME trong chiết xuất hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline [32] – pyrroline [32]
Grimm và ctv (2001) đã ứng dụng kỹ thuật SPME để khảo sát qui trình phân tích hàm lƣợng 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong gạo thơm. Theo họ, lƣợng 2 – AP thu đƣợc sẽ tăng gấp đôi khi tăng nhiệt độ từ 60oC lên 85oC. Ngƣợc lại, hàm lƣợng chất chuẩn 2,4,6 – trimethylpyridine sẽ giảm khi nhiệt độ tăng. Không có sự khác biệt đáng kể về hàm lƣợng 2 – AP khi chiết xuất mẫu ở 80°C và 85°C, do đó, 80°C đƣợc xem là điểm nhiệt độ thích hợp cho quá trình chiết suất.
Khoảng thời gian từ 10 – 15 phút đủ để thu nhận hầu hết các chất bay hơi, trong khi những thành phần ít bay hơi hơn nhƣ acid hữu cơ hay ester phải tốn hàng giờ mới có thể thu nhận đƣợc. Sau khi so sánh lƣợng 2 – AP thu đƣơc sau khoảng thời gian hấp phụ là 10, 15, 20 phút, họ đã rút ra kết luận thời gian chiết xuất mẫu phù hợp nhất là 15 phút.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc thêm nƣớc vào mẫu gạo sẽ giúp tăng hàm lƣợng 2 – AP thu nhận đƣợc, đồng thời giảm đƣợc yêu cầu phải nghiền mẫu, góp phần đơn giản hóa quá trình chuẩn bị mẫu. Lƣợng nƣớc cất tối ƣu sử dụng cho quá trình chiết suất là 200 µl.
Để xác định lƣợng 2 – AP hấp thu, diện tích peak đƣợc chuyển thành khối lƣợng bằng cách dựng đƣờng chuẩn dựa trên chuẩn 2 – AP pha loãng trong CHCl3. Theo kết quả nghiên cứu của Casey và ctv (2001), hàm lƣợng 2 – AP trung bình thu đƣợc trong mẫu gạo Jasmine khi phân tích bằng phƣơng pháp SPME là 2,2 ng trong 0,75 g gạo, tƣơng đƣơng với 2,9 ppb. Phƣơng pháp SPME phù hợp cho việc so sánh mối tƣơng quan về nồng độ 2 – AP giữa các mẫu gạo khác nhau. Nhìn chung, trong tất cả các trƣờng hợp, phƣơng pháp SPME có thể phân biệt giữa gạo thơm và gạo thông thƣờng. Cấu tử 2 – AP đƣợc phân tách ở 5 phút 42 giây, và chỉ chiếm 1 lƣợng nhỏ trong tổng số các chất bay hơi, nhƣng lƣợng này đủ để chiếm ƣu thế trong thành phần chất thơm có trong cơm gạo.
2.7. SẮC KÝ KHÍ (Gas Chromatography - GC) [10] 2.7.1. Nguyên tắc
Nguyên tắc của sắc ký khí là mỗi cấu phần trong gạo thơm sẽ bị hấp thụ trên pha tĩnh của cột phân tích khác nhau nên có thời gian lƣu khác nhau. Trên cơ sở khác
nhau về thời gian lƣu này mà ngƣời ta có thể định tính và định lƣợng cấu tử cần nghiên cứu.
2.7.2. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí
Hình 2.9. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí detector ion hóa ngọn lửa FID
Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc ký khí là hệ thống cột tách và detector. Nhờ có khí mang, mẫu từ buồng bay hơi đƣợc dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký xảy ra tại đây. Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lƣợt đi vào detector, tại đó chúng đƣợc chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này đƣợc khuếch đại rồi chuyển sang bộ ghi, tích phân kế hoặc máy vi tính. Các tín hiệu đƣợc xử lý ở đó rồi chuyển sang bộ phận in và lƣu kết quả .
Trên sắc đồ nhận đƣợc, sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tử đƣợc tách gọi là peak. Thời gian lƣu của peak là đại lƣợng đặc trƣng (định tính) cho chất cần tách. Còn diện tích của peak là thƣớc đo định lƣợng cho từng chất trong hỗn hợp cần nghiên cứu.
Hình 2.10. Sơ đồ cấu tạo hình học của detector ion hóa ngọn lửa
Detector có nhiệm vụ chuyển hóa một đại lƣợng không điện (trong trƣờng hợp này là nồng độ của các chất đƣợc tách khỏi cột sắc ký) thành đại lƣợng điện. Ngày nay, đã có gần 30 loại detector khác nhau. Trong đó, 3 loại detector phổ biến nhất là: detector dẫn nhiệt (TCD), detector ion hóa ngọn lửa (FID) và detector cộng kết điện tử (ECD).
Detector FID (hình 2.10) là một trong những detector có độ nhạy cao. Nguyên tắc làm việc của nó dựa trên sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa hydro đặt trong một điện trƣờng khi có chất hữu cơ cần tách chuyển qua. Nhờ nhiệt độ cao của ngọn lửa hydro, các chất hữu cơ từ cột tách đi vào detector bị bẻ gãy mạch, bị ion hóa nhờ có oxy của không khí để tạo thành các ion trái dấu tƣơng ứng. Các ion tạo thành đƣợc chuyển về các bản điện cực trái dấu nằm ở hai phía của ngọn lửa. Dòng ion đó đƣợc giảm áp trên một điện trở có trị số rất cao (108
– 1012 Ω) và độ giảm hiệu điện thế này đƣợc khuếch đại và ghi lại trên máy tự ghi. Số lƣợng ion tạo thành (chính là độ nhạy của detector) phụ thuộc vào các yếu tố sau:
Cấu trúc hình học của detector Tỉ lệ thành phần hydro/không khí Nhiệt độ của ngọn lửa
Cấu trúc của các phân tử mẫu cần xác định
Các hợp chất hữu cơ đƣợc đốt cháy bằng ngọn lửa hydro – không khí tạo thành các ion. Khí mang từ cột sẽ đƣợc trộn trƣớc với hydro và đốt cháy bằng ngọn lửa ở buồng đốt. Một điện cực hình trụ đƣợc đặt cách vài milimet phía trên ngọn lửa để thu
thập các ion sinh ra. Dòng ion này sẽ đƣợc đo bằng cách đặt một hiệu điện thế giữa đầu phun của ngọn lửa và điện cực hình trụ. Để hạn chế đến mức tối đa sự tái kết hợp của các ion, phải đặt điện thế chọn lọc vào vùng bão hòa (vùng mà khi tăng điện thế sẽ không làm tăng dòng ion). Các tín hiệu tạo thành sẽ đƣợc khuếch đại bằng bộ khuếch điện tử rồi qua bộ xử lý và ghi tín hiệu.
Detector FID sử dụng thích hợp nhất đối với các hợp chất chứa cacbon.
2.7.2.2. Cột mao quản
Sắc ký khí mao quản là một hình thái đặc biệt của phƣơng pháp sắc ký khí, đƣợc đặc trƣng bởi năng suất tách và hiệu suất phân giải rất cao. Sở dĩ nhƣ vậy là nhờ việc sử dụng các cột mao quản hở với chiều dài khá lớn (25m, 50m, 100m,...).
Cột mao quản (hình 2.11) là loại cột tách với đƣờng kính nhỏ hơn 1mm và thành trong của cột đƣợc tẩm pha tĩnh. Nhờ cấu trúc đặc biệt này của cột mao quản, khí mang sẽ đƣa mẫu đi qua cột tách rất dài (do vậy năng suất rất cao) mà không gặp trở kháng gì lớn (về độ chênh lệch áp suất), các cấu tử sẽ tƣơng tác với pha tĩnh bám trên thành cột và đƣợc pha tĩnh lƣu giữ lại với mức độ khác nhau,…
Hình 2.11. Cột mao quản
2.8. SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ (GC/MS) [10]
Sắc ký khối phổ là một loại sắc ký đặc biệt, vì sau khi ra khỏi cột sắc ký, các cấu phần đƣợc lần lƣợt cho vào buồng MS để thực hiện việc ghi phổ của từng cấu phần. Nhờ một phần mềm, các phổ MS này đƣợc so sánh với các phổ MS chuẩn chứa trong thƣ viện của máy tính. Do đó để tăng độ chính xác cho sự dò tìm và so sánh, thƣ viện phổ khối lƣợng cần phải có nhiều phổ chuẩn. Độ tƣơng hợp giữa phổ MS của các cấu phần và phổ mẫu có tính tƣơng đối tùy thuộc phần mềm phụ trách việc so sánh, thƣờng thì độ tƣơng hợp càng lớn thì xác suất định danh càng cao. Kinh nghiệm về thành phần hóa học và kiến thức về phổ khối lƣợng có tính quyết định rất lớn đến độ chính xác của kết quả định danh. Đầu dò phổ khối lƣợng có độ nhạy cao, khoảng 10-6
phƣơng pháp khác không thể thực hiện đƣợc. Sắc ký khối phổ có khả năng định danh cao, khả năng dò tìm nhanh, lƣợng mẫu sử dụng ít.
2.9. PHƢƠNG PHÁP KJELDAHL [5] Nguyên tắc
Trƣớc tiên mẫu đƣợc vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra nhƣ sau:
2H2SO4 = 2H2O + 2SO2↑ + O2
Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitơ dƣới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amin, carbon và hidro của acid amin tạo thành CO2 và H2O, còn nitơ đƣợc giải phóng dƣới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dƣ tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch
2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4
Các nguyên tố P, K, Ca, Mg…chuyển thành dạng oxid: P2O5, K2O, CaO, MgO…
Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH:
(NH4)2SO4 + 2NaOH = NaSO4 + H2O + 2NH3 NH3 bay ra cùng với nƣớc sang bình hứng, bình hứng chứa H3BO3
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH
Thời gian: từ 4/2006 – 8/2006.
Địa điểm lấy mẫu:
Bảng 3.1. Bảng thống kê số lƣợng mẫu lấy tại các địa điểm
Địa Điểm Loại mẫu Số Lƣợng Mẫu Các chợ bán sỉ và lẻ trên địa bàn TP. HCM Mẫu gạo 12 Các siêu thị trên địa bàn TP. HCM Mẫu gạo 5 Viện khoa học nông nghiệp miền Nam (IAS) Mẫu lúa 31 Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long Mẫu lúa 15 Siêu thị Carrefour (Pháp) Mẫu gạo 3
Tổng cộng 66
Địa điểm tiến hành thí nghiệm: trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
Vật liệu: gạo và lúa Nàng Thơm Chợ Đào.
Hóa chất sử dụng:
Hóa chất dùng trong phân tích hàm lƣợng chất thơm: ethanol (Merck), acetone (Merck), methanol (Merck), 2,4,6-collidine (2,4,6-trimethyl pyridine) (Sigma).
Hóa chất dùng trong phân tích protein: K2SO4, CuSO4, H2SO4 đđ, H3BO3 4%, chỉ thị màu, parafin, NaOH 32%, HCl 0,25N (Trung Quốc).
Dụng cụ và thiết bị:
Tủ mát, Darling (Việt Nam). Tủ lạnh, Hitachi (Japan).
Máy bóc vỏ trấu, khoa Cơ Khí Công Nghệ trƣờng đại học Nông Lâm. Cân điện tử BP 210S – Sartorius AG Gottingen (Đức).
Máy sắc ký khí HP 6890 N (G1540N) – Agilent Technologies (Mỹ). Máy sắc ký khối phổ HP 6890 N (G1530N) – Agilent Technologies (Mỹ).
Kim SPME (SupelcoTM SPME fiber holder) – Bellefonte, PA (Mỹ). Máy nhiệt từ, Ikamag (Đức).
Máy Scan, Epson Perfection 1260.
Bồn siêu âm Power sonic 510 – Hwashin Technology Co. (Hàn Quốc). Tủ sấy, Memmert (Đức).
Hệ thống phân tích đạm tự động, Gerhardt (Đức). Kìm đóng nắp, Mỹ.
Micropippet loại 10 – 100 μl, đầu típ 100 μl, cá từ, nắp nhôm. Lọ bi 10ml, Agilent (Mỹ).
Bình tam giác 250 ml (Trung Quốc).