4.2.1.1 Qui trình phản ứng PCR theo nhiệt độ bắt cặp khác nhau
Để tiến hành xác định nhiệt độ bắt cặp nào là tối hảo cho cặp primer đang tiến hành thí nghiệm chúng tôi tiến hành thực hiện 15 phản ứng trên mẫu da tai cho mỗi qui trình. Mẫu da tai đƣợc chọn do hàm lƣợng DNA cao, độ tinh sạch tƣơng đối chuẩn, phù hợp với yêu cầu của phản ứng PCR. Kết quả của hai qui trình phản ứng đƣợc trình bày ở (Bảng 4.3)
Bảng 4.3: So sánh tỉ lệ thành công giữa hai qui trình nhiệt độ khác nhau
Qui trình PCR Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỉ lệ thành công (%)
1 15 10 66,7
2 15 10 66,7
Với kết quả này thì hai qui trình nhiệt độ đều phát hiện tốt sự hiện diện của gen PRLR. Ở qui trình 1, nhiệt độ bắt cặp thấp hơn, các primer không hoàn toàn bắt cặp đặc hiệu với trình tự đích, có một số lƣợng nhỏ primer bắt cặp không đặc hiệu, tạo thành các sản phẩm phụ chuỗi dài và ngắn hơn sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR sau khi chạy điện di xuất hiện những vệt dài sáng (giống nhƣ hiện tƣợng sao chổi) kèm theo đó là các băng phụ của các đoạn DNA kích thƣớc nhỏ. Ở qui trình 2 nhiệt độ bắt cặp cao hơn 2o C, các sản phẩm PCR thu đƣợc rất đặc hiệu, không xuất hiện vệt dài sáng nhƣ ở qui trình 1. Nhƣ vậy, qui trình của Vincent khi tiến hành tại điều kiện phòng thí nghiệm của chúng ta không phù hợp và phải điều chỉnh nhiệt độ bắt cặp tăng lên khoảng 2o C.
Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 1 với nồng độ gel 1,5 %
1, 3, 5, 7: Các giếng có hiện diện sản phẩm PCR, cả 4 giếng này đều xuất hiện các vệt sáng dài
2, 4, 6, 8: Các giếng không có sự hiện diện sản phẩm PCR
Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 2 với nồng độ gel LMP 1,5 %
Giếng 1, 2, 3, 4: Sản phẩm PCR thực hiện theo qui trình 2
1 2 3 4 5 6 7 8 Các vệt dài sáng Sản phẩm PCR 1’ 1 2’ 2 3’ 3 4’ 4 Sản phẩm PCR Các băng phụ kích thƣớc nhỏ (hiện tƣợng dimer – primer)
4.2.1.2 Qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau
Để tiến hành xác định nồng độ primer thích hợp nhất cho phản ứng PCR phát hiện gen thụ thể prolactin, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR trên mẫu da tai. Mỗi qui trình tiến hành 15 phản ứng. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau (Bảng 4.4):
Bảng 4.4: So sánh tỉ lệ thành công giữa ba qui trình phản ứng PCR theo nồng độ
primer khác nhau
Qui trình PCR Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỉ lệ thành công (%)
1 15 0 0
2 15 9 60
3 15 9 60
Qua kết quả ở Bảng 4.4 thì qui trình 2, 3 phát hiện tốt sự hiện diện của gen PRLR. Qui trình 1 không phát hiện đƣợc sự hiện diện của gen PRLR. Sản phẩm PCR sau khi điện di và nhuộm gel thì không thấy xuất hiện các băng DNA. Ở qui trình 3 nồng độ primer cao, primer sau khi bắt cặp vào DNA khuôn còn thừa tạo ra các băng phụ kích thƣớc nhỏ (hiện tƣợng dimer – primer). Qui trình 2 cho kết quả hoàn toàn nhƣ mong muốn, các băng DNA xuất hiện rõ ràng, các băng DNA hiện diện rõ ràng. Sản phẩm PCR của qui trình này có thể dùng xử lý enzyme giới hạn.
Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 1 với nồng độ gel LMP 1,5 %
Các giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: Không có sự hiện diện sản phẩm PCR
Hình 4.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 2 với nồng độ gel LMP 1,5 %
Giếng 1’, 2’, 3’, 4’: sản phẩm PCR đƣợc thực hiện bởi cặp primer của Drogemuller đƣợc thực hiện bởi Bùi Thị Trà Mi lớp Chăn Nuôi – Thú Y 27 Giếng 1, 2, 3, 4: Sản phẩm PCR thực hiện theo qui trình 2
1 2 3 4 5 6 7 8
1’ 1 2’ 2 3’ 3 4’ 4
Sản phẩm PCR theo qui trình 2
Hình 4.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 3 với nồng độ gel 1,5 % 4.2.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo hai loại mẫu khác nhau
Chúng tôi đã tiến hành thực hiện phản ứng PCR với 2 loại mẫu khác nhau, kết quả thu đƣợc nhƣ Bảng 4.5 sau:
Bảng 4.5: So sánh tỉ lệ thành công của phản ứng PCR với hai loại mẫu khác nhau
Loại mẫu Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỉ lệ thành công (%)
Máu 10 3 30
Da tai 10 7 70
Mẫu máu có tỉ lệ thành công thấp hơn mẫu da tai. Các loại protein của máu chủ yếu là các phân tử hemoglobin có chứa nhóm heme (Nguyễn Phƣớc Nhuận, 2003). Theo Erlich nhóm này ức chế mạnh đến hoạt động của Taq polymerase ( trích dẫn bởi Lê Thị Thu Phƣơng, 2003). Do Taq polymerase bị ức chế nên phản ứng PCR có hiệu quả thấp trong việc xác định gen PRLR.
1 2 3 4 5 6 7 8
Các băng phụ chuỗi ngắn
Hình 4.6: Kích thƣớc của sản phẩm PCR
Ghi chú: 1, 2,3 :sản phẩm PCR đƣợc thực hiện bởi cặp primer của A.L Vincent LD (ladder): 100 bp
4.3 Kết quả thực hiện cắt enzyme giới hạn trên các nồng độ khác nhau
Việc xử lý enzyme là một trong những công đoạn quan trọng trong việc xác định tần số xuất hiện của các kiểu gen thụ thể prolactin. Đây là công đoạn rất tốn kém, đòi hỏi chi phí cao khi thao tác trên số lƣợng mẫu lớn. Do đó, việc xác định nồng độ, thể tích của các enzyme tham gia vào quá trình phân cắt sao cho hiệu quả nhất và kinh tế nhất là rất cần thiết. Kết quả của việc cắt enzyme theo các qui trình khác nhau đƣợc trình bày ở bảng 4.6 dƣới đây:
Bảng 4.6: So sánh tỉ lệ thành công giữa các nồng độ cắt enzyme khác nhau
Nồng độ Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỉ lệ % thành công
1 10 0 0
2 10 10 100
3 10 10 100
Xử lý enzyme theo qui trình của nhà sản xuất không thành công. Sản phẩm sau khi xử lý enzyme không thấy sự phân cắt của enzyme. Đây là qui trình chuẩn yêu cầu
1000 bp
400 bp 390 bp
lƣợng DNA của mẫu đƣa vào tƣơng đối chính xác, lƣợng enzyme sử dụng tƣơng đối cao. Sản phẩm PCR của chúng ta sau khi thu đƣợc thể tích khoảng 25 µl, nồng độ rất khó định lƣợng, không thể đạt đến mức 1000 ng / µl . Nhƣ vậy, việc thực hiện theo qui trình này vừa không hiệu quả, vừa tốn kém.
Ở qui trình 2, qui trình 3 các sản phẩm sau khi điện di cho kết quả rất tốt, các băng thể hiện rất rõ. Nhƣ vậy không có sự khác biệt giữa qui trình 2 và qui trình 3. Nhƣng vì lý do kinh tế nên chúng tôi quyết định chọn qui trình 3 sử dụng trong công tác phân tích gen thụ thể prolactin.
Trong việc xử lý enzyme giới hạn này có nhiều vấn đề cần đƣợc quan tâm: Nồng độ gel dùng để điện di:
Sản phẩm phân cắt enzyme là các đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng đối ngắn từ 50 – 121 bp. Nên chúng ta cần sử dụng nồng độ gel cao từ 2.5 – 6 %. Nếu chúng ta sử dụng nồng độ gel thấp thì các băng DNA sau khi phân cắt sẽ bị nhoè, không phân biệt rõ ràng. Trƣờng hợp cụ thể ở đây là sử dụng nồng độ gel 3.5 %, nhƣng theo các nghiên cứu về gen PRLR của Vincent thì ông sử dụng nồng độ gel 6 %.Với nồng độ gel đậm đặc nhƣ thế sẽ tạo ra kích thƣớc lổ gel nhỏ giúp cho các đoạn DNA kích thƣớc nhỏ phân biệt một cách rõ ràng, nhƣng khá tốn kém.
Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme giới hạn AluI với nồng độ gel 2 %
LD: ladder 25 bp
Các giếng 1, 2, 3,...,16 không thể phân biệt đƣợc các băng DNA Hiệu điện thế và cƣờng độ dòng điện
1 2 3 4 LD 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 LD
Các băng DNA bị nhoè
Hiệu điện thế và cƣờng độ dòng điện đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình điện di. Hiệu điện thế và cƣờng độ dòng điện cao quá sẽ làm cho các đoạn DNA di chuyển nhanh, các đoạn DNA phân tán không tập trung lại thành một băng có kích thƣớc lớn gây khó khăn trong việc xác định, phân biệt kích thƣ ớc của các đoạn DNA. Hiện tƣợng này chỉ đƣợc thấy rõ qua các đoạn DNA có kích thƣớc dƣới 100 bp.
Các nghiên cứu của tác giả A.L. Vincent thì sự xuất hiện của các băng DNA có kích thƣớc 90 bp: alen A; 110 bp: alen B sau khi phân cắt là có thể xác định đƣợc kiểu gen của heo.
Hình 4.8: Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme với gel LMP 3,5 %
Các giếng bỏ trống và đánh số không phải sản phẩm cắt enzyme trong khoá luận này
AB, BB: Các kiểu gen PRLR
4.4 Tần số xuất hiện của các kiểu gen trong quần thể
Sau khi xây dựng thành công qui trình thực hiện kỹ thuật PCR và qui trình cắt enzyme hiệu quả nhất thì chúng tôi tiến hành áp dụng các kết quả đạt đƣợc vào việc xác định sự hiện diện của gen thụ thể prolactin và tần số xuất hiện của các kiểu gen thụ thể prolactin.
110 bp
AB BB LA BB BB BB LA
66 bp 25 bp 76 bp 124 bp
Sự hiện diện của gen thụ thể prolactin Bảng 4.7: Tỉ lệ xuất hiện của gen PRLR
Số mẫu Tỉ lệ %
Có sự hiện diện của gen PLRL 23 76,67
Không có sự hiện diện của gen
PLRL 7 23,33
Tỉ lệ sự xuất hiện của các kiểu gen PRLR
Với 30 mẫu ly trích sau khi thực hiện phản ứng PCR thì thu đƣợc 23 mẫu có sự xuất hiện gen PRLR. Xử lý 23 mẫu này với AluI theo qui trình 2 bảng 3.3 để xác định kiểu gen. Kết quả đƣợc trình bày nhƣ bảng 4.8 sau:
Bảng 4.8: Tỉ lệ xuất hiện của các kiểu gen PRLR
Kiểu gen Số mẫu Tỉ lệ, %
AA 1 3,33
AB 7 23,33
3.33 23.33 50 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 Kiểu gen Series1
Hình 4.9: Tỉ lệ xuất hiện của các kiểu gen PRLR
Tỉ lệ (%)
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Qua thời gian khảo sát chúng tôi ghi nhận đƣợc các kết quả sau:
Tần số xuất hiện của gen thụ thể prolactin
Qua quá trình phân tích kiểm tra 30 mẫu lấy lừ 30 heo nái giống Yorkshire thì tần số xuất hiện của gen này chiếm tỉ lệ 76,67 % so với tổng số mẫu phân tích. Tỉ lệ này chiếm khá cao.
Tần số xuất hiện của các kiểu gen thụ thể prolactin
Cả ba kiểu gen thụ thể prolactin đều xuất hiện trên giống Yorkshire. Tần số kiểu gen BB chiếm tỉ lệ cao nhất (50 %), kiểu gen AB chiếm tỉ lệ 23,3 %, kiểu gen AA chiếm tỉ lệ thấp nhất (3,33 %).
Các heo nái có kiểu gen AA theo các báo cáo của A. L. Vincent (1998), Drogemuller (2001)…có năng suất sinh sản cao hơn các kiểu gen khác nhƣng do số mẫu phân tích chƣa đủ lớn nên không có những kết luận về mối tƣơng quan giữa năng suất sinh sản với kiểu gen AA.
5.2 Kiến nghị
Đƣa kỹ thuật xét nghiệm này vào công tác di truyền và chọn giống
Tiếp tục khảo sát với lƣợng mẫu lớn hơn, thu thập đầy đủ các số liệu về năng suất sinh sản của các heo nái để có cơ sở đánh giá chính xác ảnh hƣởng của gen thụ thể prolactin lên năng suất sinh sản của nái.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bùi Chí Bửu - Nguyễn Thị Lang, 1999, Di truyền phân tử những nguyên tắc cơ bản
trong chọn giống cây trồng, NXB Nông Nghiệp TP. HCM
2. Trần Thị Dân, 2000, Bài giảng sinh lý học gia súc, khoa Chăn Nuôi - Thú Y bộ môn sinh lý, sinh hóa trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM.
3. Lê Đình Lƣơng, 2001, Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội 4. PGS. TS Nguyễn Phƣớc Nhuận, 2003, Giáo trình sinh hoá học - Phần I: Sinh hoá
học tĩnh, NXB Đại học quốc gia TP. HCM
5. Lê Thị Thu Phƣơng, 2003, Ứng dụng k ỹ thuật PCR phát hiện gen thụ thể estrogen và gen halothan, LVTS khoa Chăn nuôi Thú y trƣờng đại học Nông Lâm TP. HCM. 6. W. D. Phillips – T.J. Chilton, 1998, Sinh học - Tập 1, NXB Giáo Dục
7. Trịnh Ngọc Thu Trang, 2004, Khảo sát sức sinh sản của một số nhóm giống tại xí
nghiệp lợn giống Đông Á, LVTN khoa Chăn Nuôi - Thú Y trƣờng đại học Nông Lâm
TP. HCM.
8. Trần Thị Thuỳ Trang, 2003, Khảo sát ảnh hưởng của gen thụ thể estrogen và gen
halothan lên năng suất sinh sản của heo nái, LVTN khoa chăn nuôi thú Y trƣờng đại
học Nông Lâm TP. HCM.
9. Bùi Trang Việt, 2003, Giáo trình sinh học phân tử, đại học quốc gia TP. HCM khoa sinh học trƣờng ĐH KHTN.
TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI
1. T.A. Brown, 1999, Gen clonning an introduction – Third editor, Chapman and hall, London, UK
2. C. Drogemuller, H. Hamann, and O. Distl, 2001, Cadidate gene markers for litter
size in different German pigs line, J. Anim. Sci. 2001. 79: 2565 – 2570
3. S.T Nicholl, 1994, An introduction to geneticengineering, Camdridge University, UK A.M Griffin, H.G Griffin, PCR technology current innovation, CRC press, London, UK 4. A. L. Vincent, G. Evans’, T.H. Short, C.K. Tuggle, and M.F. Rothschild’, 1998, The
prolactin receptor gene is asociated with increased litter size in pigs, Department of
CÁC TRANG WEB TỪ INTERNET: http://mark.asci.ncsu.edu/nsif/00proc/islerposter.htm http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids =12559630&dopt=Citation http://iowa.thearkdb.org/browser?objtype=reference&objopr=retrieve&species=pig&r ef_uid=582 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=2894986
MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU ... 1 1.1 Đặt vấn đề ... 1 1.2 Mục đích - yêu cầu ... 1 1.2.1 Mục đích ... 1 1.2.2 Yêu cầu ... 1 PHẦN 2: TỔNG QUAN ... 3
2.1 Giới thiệu sơ lƣợc về giống heo Yorshire ... 3
2.1.1 Prolactin ... 3
2.1.1.1 Nguồn gốc, cấu tạo ... 3
2.1.1.2 Tác dụng của prolactin ... 3
2.1.1.3 Cơ chế tác động của prolactin ... 4
2.1.1.4 Gen thụ thể prolactin ... 5
2.2 Giới thiệu về DNA (Deoxiribonucleotide acid) ... 6
2.2.1 Cơ chế tự nhân đôi của DNA ... 8
2.2.2 Gen, allen và sự đa hình của gen... 10
2.2.2.1 Gen ... 10
2.2.2.1.1 Sự biểu hiện của gen hay sự điều hoà hoạt động của gen ... 10
2.2.2.1.2 Sự liên kết giữa gen và marker ... 11
2.2.2.2 Allen và sự đa hình của gen ... 11
2.2.3 Phƣơng pháp chiết tách DNA từ mô động vật ... 12
2.2.4 Phƣơng pháp định tính và định lƣợng cho DNA ... 13
2.2.4.1 Định lƣợng bằng phƣơng pháp đo OD (optical density) ... 13
2.2.4.2 Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di ... 13
2.3 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ... 14
2.3.1 Giới thiệu về phản ứng PCR ... 14
2.3.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR ... 14
2.3.2.1 Taq polymerase ... 14
2.3.2.2 Các nucleotid ... 15
2.3.2.3 Primer (mồi) ... 15
2.3.2.5 DNA khuôn ... 16
2.3.2.6 Số chu kỳ phản ứng ... 16
2.3.2.7 Nhiệt độ và pH ... 16
2.3.2.6 Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục ... 16
2.3.2.7 Ứng dụng của PCR ... 18
2.4 Giới thiệu về kỹ thuật RFLP và kỹ thuật PCR – RFLP ... 18
2.4.1 Kỹ thuật RFLP ( restricton fragment length polymorphism)... 18
2.4.2 Kỹ thuật PCR – RFLP ... 19
2.5 Các enzyme giới hạn ... 20
PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT ... 21
3.1 Thời gian, địa điểm ... 21
3.1.1 Thời gian ... 21
3.1.2 Địa điểm ... 21
3.2 Đối tƣợng khảo sát ... 21
3.3 Nội dung thực hiện ... 21
3.4 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu ... 21
3.4.1 Vật liệu, dụng cụ, máy móc và thiết bị làm thí nghiệm ... 21
3.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ... 22
3.4.2.1 Thu thập mẫu ... 22
3.4.2.2 Ly trích DNA ... 23
3.4.2.3 Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế... 24
3.4.2.4 Ứng dụng phƣơng pháp PCR – RFLP khảo sát sự đa hình của gen PRLR .... 24
3.4.2.4.1 Xây dựng qui trình khuyếch đại PCR và cắt enzyme giới hạn ... 24
3.4.2.5 Ứng dụng PCR phát hiện ra gen thụ thể prolactin và xác định tần số các kiểu gen PRLR trên các mẫu phân tích ... 27
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 30
4.1 Hiệu quả ly trích DNA từ mẫu máu và mẫu da tai ... 30
4.1.1 Mẫu máu ... 30
4.1.1 Mẫu da tai ... 31
4.2 Kết quả việc thực hiện phản ứng PCR ... 33