Sau khi xây dựng thành công qui trình thực hiện kỹ thuật PCR và qui trình cắt enzyme hiệu quả nhất thì chúng tôi tiến hành áp dụng các kết quả đạt đƣợc vào việc xác định sự hiện diện của gen thụ thể prolactin và tần số xuất hiện của các kiểu gen thụ thể prolactin.
110 bp
AB BB LA BB BB BB LA
66 bp 25 bp 76 bp 124 bp
Sự hiện diện của gen thụ thể prolactin Bảng 4.7: Tỉ lệ xuất hiện của gen PRLR
Số mẫu Tỉ lệ %
Có sự hiện diện của gen PLRL 23 76,67
Không có sự hiện diện của gen
PLRL 7 23,33
Tỉ lệ sự xuất hiện của các kiểu gen PRLR
Với 30 mẫu ly trích sau khi thực hiện phản ứng PCR thì thu đƣợc 23 mẫu có sự xuất hiện gen PRLR. Xử lý 23 mẫu này với AluI theo qui trình 2 bảng 3.3 để xác định kiểu gen. Kết quả đƣợc trình bày nhƣ bảng 4.8 sau:
Bảng 4.8: Tỉ lệ xuất hiện của các kiểu gen PRLR
Kiểu gen Số mẫu Tỉ lệ, %
AA 1 3,33
AB 7 23,33
3.33 23.33 50 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 Kiểu gen Series1
Hình 4.9: Tỉ lệ xuất hiện của các kiểu gen PRLR
Tỉ lệ (%)
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Qua thời gian khảo sát chúng tôi ghi nhận đƣợc các kết quả sau:
Tần số xuất hiện của gen thụ thể prolactin
Qua quá trình phân tích kiểm tra 30 mẫu lấy lừ 30 heo nái giống Yorkshire thì tần số xuất hiện của gen này chiếm tỉ lệ 76,67 % so với tổng số mẫu phân tích. Tỉ lệ này chiếm khá cao.
Tần số xuất hiện của các kiểu gen thụ thể prolactin
Cả ba kiểu gen thụ thể prolactin đều xuất hiện trên giống Yorkshire. Tần số kiểu gen BB chiếm tỉ lệ cao nhất (50 %), kiểu gen AB chiếm tỉ lệ 23,3 %, kiểu gen AA chiếm tỉ lệ thấp nhất (3,33 %).
Các heo nái có kiểu gen AA theo các báo cáo của A. L. Vincent (1998), Drogemuller (2001)…có năng suất sinh sản cao hơn các kiểu gen khác nhƣng do số mẫu phân tích chƣa đủ lớn nên không có những kết luận về mối tƣơng quan giữa năng suất sinh sản với kiểu gen AA.
5.2 Kiến nghị
Đƣa kỹ thuật xét nghiệm này vào công tác di truyền và chọn giống
Tiếp tục khảo sát với lƣợng mẫu lớn hơn, thu thập đầy đủ các số liệu về năng suất sinh sản của các heo nái để có cơ sở đánh giá chính xác ảnh hƣởng của gen thụ thể prolactin lên năng suất sinh sản của nái.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bùi Chí Bửu - Nguyễn Thị Lang, 1999, Di truyền phân tử những nguyên tắc cơ bản
trong chọn giống cây trồng, NXB Nông Nghiệp TP. HCM
2. Trần Thị Dân, 2000, Bài giảng sinh lý học gia súc, khoa Chăn Nuôi - Thú Y bộ môn sinh lý, sinh hóa trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM.
3. Lê Đình Lƣơng, 2001, Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội 4. PGS. TS Nguyễn Phƣớc Nhuận, 2003, Giáo trình sinh hoá học - Phần I: Sinh hoá
học tĩnh, NXB Đại học quốc gia TP. HCM
5. Lê Thị Thu Phƣơng, 2003, Ứng dụng k ỹ thuật PCR phát hiện gen thụ thể estrogen và gen halothan, LVTS khoa Chăn nuôi Thú y trƣờng đại học Nông Lâm TP. HCM. 6. W. D. Phillips – T.J. Chilton, 1998, Sinh học - Tập 1, NXB Giáo Dục
7. Trịnh Ngọc Thu Trang, 2004, Khảo sát sức sinh sản của một số nhóm giống tại xí
nghiệp lợn giống Đông Á, LVTN khoa Chăn Nuôi - Thú Y trƣờng đại học Nông Lâm
TP. HCM.
8. Trần Thị Thuỳ Trang, 2003, Khảo sát ảnh hưởng của gen thụ thể estrogen và gen
halothan lên năng suất sinh sản của heo nái, LVTN khoa chăn nuôi thú Y trƣờng đại
học Nông Lâm TP. HCM.
9. Bùi Trang Việt, 2003, Giáo trình sinh học phân tử, đại học quốc gia TP. HCM khoa sinh học trƣờng ĐH KHTN.
TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI
1. T.A. Brown, 1999, Gen clonning an introduction – Third editor, Chapman and hall, London, UK
2. C. Drogemuller, H. Hamann, and O. Distl, 2001, Cadidate gene markers for litter
size in different German pigs line, J. Anim. Sci. 2001. 79: 2565 – 2570
3. S.T Nicholl, 1994, An introduction to geneticengineering, Camdridge University, UK A.M Griffin, H.G Griffin, PCR technology current innovation, CRC press, London, UK 4. A. L. Vincent, G. Evans’, T.H. Short, C.K. Tuggle, and M.F. Rothschild’, 1998, The
prolactin receptor gene is asociated with increased litter size in pigs, Department of
CÁC TRANG WEB TỪ INTERNET: http://mark.asci.ncsu.edu/nsif/00proc/islerposter.htm http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids =12559630&dopt=Citation http://iowa.thearkdb.org/browser?objtype=reference&objopr=retrieve&species=pig&r ef_uid=582 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=2894986
MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU ... 1 1.1 Đặt vấn đề ... 1 1.2 Mục đích - yêu cầu ... 1 1.2.1 Mục đích ... 1 1.2.2 Yêu cầu ... 1 PHẦN 2: TỔNG QUAN ... 3
2.1 Giới thiệu sơ lƣợc về giống heo Yorshire ... 3
2.1.1 Prolactin ... 3
2.1.1.1 Nguồn gốc, cấu tạo ... 3
2.1.1.2 Tác dụng của prolactin ... 3
2.1.1.3 Cơ chế tác động của prolactin ... 4
2.1.1.4 Gen thụ thể prolactin ... 5
2.2 Giới thiệu về DNA (Deoxiribonucleotide acid) ... 6
2.2.1 Cơ chế tự nhân đôi của DNA ... 8
2.2.2 Gen, allen và sự đa hình của gen... 10
2.2.2.1 Gen ... 10
2.2.2.1.1 Sự biểu hiện của gen hay sự điều hoà hoạt động của gen ... 10
2.2.2.1.2 Sự liên kết giữa gen và marker ... 11
2.2.2.2 Allen và sự đa hình của gen ... 11
2.2.3 Phƣơng pháp chiết tách DNA từ mô động vật ... 12
2.2.4 Phƣơng pháp định tính và định lƣợng cho DNA ... 13
2.2.4.1 Định lƣợng bằng phƣơng pháp đo OD (optical density) ... 13
2.2.4.2 Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di ... 13
2.3 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ... 14
2.3.1 Giới thiệu về phản ứng PCR ... 14
2.3.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR ... 14
2.3.2.1 Taq polymerase ... 14
2.3.2.2 Các nucleotid ... 15
2.3.2.3 Primer (mồi) ... 15
2.3.2.5 DNA khuôn ... 16
2.3.2.6 Số chu kỳ phản ứng ... 16
2.3.2.7 Nhiệt độ và pH ... 16
2.3.2.6 Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục ... 16
2.3.2.7 Ứng dụng của PCR ... 18
2.4 Giới thiệu về kỹ thuật RFLP và kỹ thuật PCR – RFLP ... 18
2.4.1 Kỹ thuật RFLP ( restricton fragment length polymorphism)... 18
2.4.2 Kỹ thuật PCR – RFLP ... 19
2.5 Các enzyme giới hạn ... 20
PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT ... 21
3.1 Thời gian, địa điểm ... 21
3.1.1 Thời gian ... 21
3.1.2 Địa điểm ... 21
3.2 Đối tƣợng khảo sát ... 21
3.3 Nội dung thực hiện ... 21
3.4 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu ... 21
3.4.1 Vật liệu, dụng cụ, máy móc và thiết bị làm thí nghiệm ... 21
3.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ... 22
3.4.2.1 Thu thập mẫu ... 22
3.4.2.2 Ly trích DNA ... 23
3.4.2.3 Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế... 24
3.4.2.4 Ứng dụng phƣơng pháp PCR – RFLP khảo sát sự đa hình của gen PRLR .... 24
3.4.2.4.1 Xây dựng qui trình khuyếch đại PCR và cắt enzyme giới hạn ... 24
3.4.2.5 Ứng dụng PCR phát hiện ra gen thụ thể prolactin và xác định tần số các kiểu gen PRLR trên các mẫu phân tích ... 27
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 30
4.1 Hiệu quả ly trích DNA từ mẫu máu và mẫu da tai ... 30
4.1.1 Mẫu máu ... 30
4.1.1 Mẫu da tai ... 31
4.2 Kết quả việc thực hiện phản ứng PCR ... 33
4.2.1 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo các qui trình khác nhau ... 33
4.2.1.2 Qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau ... 35
4.3 Kết quả thực hiện cắt enzyme giới hạn trên các qui trình khác nhau ... 38
4.4 Tần số xuất hiện của các kiểu gen trong quần thể ... 40
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ... 43
5.1 Kết luận ... 43
PHỤ LỤC
Khối lƣợng phân tử của một số hoá chất sử dụng trong thí nghiệm
Tris HCl ( pH = 8) 157.64 g / mol Na2EDTA 372,24 g / mol SDS 288,38 g / mol MgCl2.6H2O 203,3 g / mol KCl 74,55 g / mol NaCl 58.5 g / mol H3PO4 61.81 g / mol
Sodium acetat 163.1 g / mol
Hoá chất cho ly trích TE 1X Tris HCl Na2EDTA Nƣớc cất 2 lần vô trùng vừa đủ Proteinase K
Phenol / chloroform / isoamyl (25:24:1) Ethanol lạnh
Ethanol tuyệt đối
Hoá chất dùng cho PCR Taq polymerase Primer F Primer R dNTPs PCR buffer 10X Tris HCl
Hoá chất dùng cho cắt enzyme
Buffer 10 X
BSA (Bovine serum albumin)
Hoá chất dùng cho điện di
TBE 0.5 X 0.9 M
Na2EDTA 20 mM
Tris bazơ 0.9 M
Nƣớc cất vô trùng vừa đủ
Hoá chất dùng cho nhuộm gel
Dung dịch ethium bromide 10 mg / ml
TBE 1X Loading dye Bromophenol blue 0.25 % Sucrose 40 % TE 1X vừa đủ 100 % DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Cơ chế tác động của prolactin tại tế bào mục tiêu ... 4
Hình 2.2: Cấu trúc của các loại bazơ hữu cơ ... 7
Hình 2.3: Cấu trúc tổng quát của 4 loại nucleotide ... 7
Hình 2.4: Sự nhân bản DNA ... 9
Hình 2.5: Các chu kỳ của phản ứng PCR ... 14
Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 1 với nồng độ gel 1,5 % ... 34
Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 2 với nồng độ gel LMP 1,5 %... 34
Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 1 với nồng độ gel LMP 1,5 % ... 36
Hình 4.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 2 với nồng độ gel LMP 1,5 % ... 36
Hình 4.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 3 với nồng độ gel 1,5 % ... 37
Hình 4.6: Kích thƣớc của sản phẩm PCR ... 38
Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme giới hạn AluI với nồng độ gel 2 % ... 39
Hình 4.8: Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme với gel LMP 3,5 % ... 40
Hình 4.9: Tỉ lệ % xuất hiện của các kiểu gen PRLR ... 42
Bảng 2.1: Các thông số của gen thụ thể prolactin lấy từ genbank ... 6
Bảng 2.2: Các yếu tố cần thiết cho sự tự nhân đôi của DNA ... 9
Bảng 2.3: Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục ... 17
Bảng 3.1: Nhiệt độ và thời gian của 2 qui trình phản ứng PCR ... 25
Bảng 3.2: Nồng độ cuối của 3 qui trình thực hiện phản ứng PCR ... 26
Bảng 3.3: Nồng độ và thể tích của các qui trình cắt enzyme AluI ... 27
Bảng 4.1: Tỉ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc từ các mẫu máu ... 30
Bảng 4.2: Tỉ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc từ các mẫu da tai ... 32
Bảng 4.3: So sánh tỉ lệ thành công giữa hai qui trình nhiệt độ khác nhau ... 33
Bảng 4.4: So sánh tỉ lệ thành công giữa ba qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau ... 35
4.2.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo hai loại mẫu khác nhau ... 37
Bảng 4.5: So sánh tỉ lệ thành công của phản ứng PCR với hai loại mẫu khác nhau ... 37
Bảng 4.6: So sánh tỉ lệ thành công giữa các qui trình cắt enzyme khác nhau ... 38
Bảng 4.7: Tỉ lệ % xuất hiện của gen PRLR... 41