Trong thực tế đậu xanh được sản xuất dễ dàng và hoàn toàn không có nhu cầu nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tuy nhiên việc nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu xanh khó có thể thực hiện và thành công được nếu trước hết không tiến hành việc tái sinh cây đậu xanh. Rudrabhatla Sairam và cs (2005) đã tổng hợp các kết quả nghiên cứu phát triển kỹ thuật tái sinh ở cây một lá mầm và cây hai lá mầm. Sự tái sinh cây được thực hiện bằng nuôi cấy in vitro từ phôi soma hoặc từ một bộ phận khác độc lập trên cơ thể và điều đó còn phụ thuộc vào genotype của giống [41]. Đối với cây ngô, sự tái sinh cây có thể thực hiện từ mô sẹo hoặc tạo đa chồi; tạo đa chồi từ hạt nảy mầm ở cây Sorghum; tạo
mô sẹo từ hạt nảy mầm, tạo phôi soma từ mô sẹo và tái sinh chồi từ mô sẹo ở cây Lolium; tạo đa chồi từ cuống lá của cây Begonia; tạo mô sẹo và tái sinh từ lá hay cuống lá ở cây Geranium, nuôi cấy in vitro phôi soma từ tế bào nuôi cấy huyền phù ở cây đậu đũa (Vigna unguiculata) được thực hiện bởi Ramakrishnan và cs (2005) [33] và bằng phương pháp này đã thu tần số tái sinh cây cao (Prem và cs, 2001) [38] … Đối với cây đậu tương sự tái sinh cây tạo đa chồi từ mắt lá mầm đã được nghiên cứu, tuy nhiên đậu tương là đối tượng thực vật rất khó thực hiện nuôi cấy in vitro từ khâu khử trùng, tạo mô sẹo, tái sinh cây, tạo rễ và ra cây [6]. Nghiên cứu khả năng tái sinh của 27 giống thuộc loài Vigna có nguồn gốc từ Phillipine, Madagascar, Pakistan, India, Australia, China, Japan Renato và cs (1999, 2001) đã cho thấy kỹ thuật tái sinh cây từ mắt lá mầm của hạt nảy mầm 4 ngày tuổi đạt hiệu quả tái sinh 80% - 100% và tái sinh chồi trực tiếp từ mắt lá mầm như là chỉ thị cho hệ gen của loài đậu Vigna châu Á (subgenus Ceratotropis) [42], [43]. Các kết quả nghiên cứu tái sinh cây ở đậu xanh từ phôi soma và từ mắt lá mầm phục vụ chuyển gen cũng đã được công bố bởi Jayanti Sen và Spra Guha Mukherjee (1998) [32], Ignacimuthu và Franklin (1999) [31], Renato và cs (1999, 2001) [41], [42], Mai Trường và cs (2001) [16], Sita và cs (2006) [44], Kaviraj và cs (2006) [34]. Sonia và cs (2007) [45] nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein ức chế enzyme α-amylase vào cây đậu xanh nhờ vi khuẩn Agrobacterium được thực hiện nhờ tái sinh đa chồi từ mắt lá mầm. Đánh giá hiệu quả chuyển gen ở cây Vigna mungo khi sử dụng kỹ thuật cấy mô từ mắt lá mầm của Muruganantham và của Amutha và cs (2006) cũng đã khẳng định hiệu quả của phương pháp này [36].
Chƣơng 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Nguyên liệu thực vật
Tám giống đậu xanh do bộ môn hệ thống canh tác của Viện nghiên cứu ngô cung cấp được sử dụng làm nguyên liệu nghiên cứu là: VN93-1; VN99-1; VC1973A; VC3902A; VC6148; VC6372; VC2768A; ĐX06. Đặc điểm của các giống đậu xanh trên được thể hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Đặc điểm của các giống đậu xanh nghiên cứu
STT Tên giống Nguồn gốc Màu sắc hạt dHình
ạng hạt Khchảịu h năng ạn
1 VN93 - 1 Nghiên cGiống lai trong nứu Ngô lai tướạo) c (Viện không bóng Xanh - Tròn Khá
2 VN99- 3
Giống lai khác loài trong
nước (Viện Viện Nghiên cứu
Ngô lai tạo -VN93-1 x Vigna
mungo)
Xanh nâu –
không bóng Tròn Trung bình
3 VC1973A Nhtiến Rau màu Quập nội từ Trung tâm Cốc tế ải Xanh nâu –bóng Tròn Trung bình
4 ĐX06 Nhti ập nội từ Trung tâm Cải
ến Rau màu Quốc tế
Xanh nâu –
không bóng Tròn Trung bình
5 VC3902A Nhtiến Rau màu Quập nội từ Trung tâm Cốc tế ải Xanh nâu –bóng Tròn Trung bình
6 VC6148 Nhti ập nội từ Trung tâm Cải ến Rau màu Quốc tế Xanh nâu – bóng Tròn Trung bình 7 VC 6372 Nhti ập nội từ Trung tâm Cải ến Rau màu Quốc tế Xanh nâu –bóng Tròn Trung bình
8 VC 2768A Nhti ập nội từ Trung tâm Cải
ến Rau màu Quốc tế
Xanh nâu –
2.1.2. Hoá chất và thiết bị
- Sử dụng các loại hoá chất thông dụng như 2,4D (Diclorphenoxyacetic acid), α- NAA (acid α – naphthylacetic), BAP (6 – Benzyl amino Purin), các chất khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, nước dừa, agarose, glucose và nhiều hoá chất thông dụng khác.
- Sử dụng các thiết bị như: Cân điện tử (Đức), buồng cấy vô trùng (Nuare, Mỹ), nồi khử trùng (Tomy,Nhật), máy đo pH …
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 8 năm 2008 đến tháng 8 năm 2009 tại Phòng công nghệ tế bào thực vật thuộc khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
Các bước nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ tổng quát sau:
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
Tạo đa chồi từ mắt lá mầm Thăm dò môi trường nuôi cấy in vitro
HẠT ĐẬU XANH
Tạo mô sẹo
Xử lý thổi khô
2.2.1. Nhóm phƣơng pháp nuôi cấy in vitro
* Tạo mô sẹo từ hạt đậu xanh
Khử trùng hạt
Mẫu vật ở ngoài môi trường nuôi cấy có thể có nấm mốc và vi khuẩn vì vậy cần phải khử trùng để loại bỏ.
- Khử trùng hạt ngoài buồng cấy: Hạt đậu xanh được rửa bằng nước máy, sau đó rửa sạch bằng xà phòng, cuối cùng tráng lại nhiều lần bằng nước cất.
- Khử trùng trong buồng cấy: Hạt đậu xanh được khử trùng trong điều kiện vô trùng bằng cồn trong thời gian 1 phút, tráng lại bằng nước cất khử trùng 1 đến 2 lần. Thêm dung dịch Javen lắc đều trong 20 - 25 phút, sau đó rửa bằng nước cất khử trùng 3 đến 4 lần. Thí nghiệm với nồng độ cồn 60%,70%,80%, 90%, nồng độ javen 50%,60%,70%. Ngâm hạt đã được khử trùng trong khoảng thời gian 5 giờ.
Tạo mô sẹo
Hạt đậu xanh đã khử trùng được đặt lên đĩa petri có lót giấy thấm vô trùng, dùng panh và dao mỏng tách bỏ lớp vỏ và phần nội nhũ, thu phôi đặt lên môi trường MS cơ bản có bổ sung 2,4D nồng độ từ 3 - 13mg/l, saccharose 3%, agar 0,9%, pH 5,8. Nuôi 1 tuần trong tối và 3 ngày dưới ánh sáng đèn phòng nuôi cấy với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ 250
C ± 10C. Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo theo công thức:
t cp N N
Ci (%)
Trong đó:Ncp là số hạt tạo mô sẹo Nt là tổng số hạt nuôi cấy Ci là tỷ lệ tạo mô sẹo (%)
Đánh giá tốc độ phát triển của mô sẹo của các giống thông qua chỉ số tăng trưởng của khối mô sẹo thu được sau 10 ngày nuôi cấy
Tái sinh cây
Mô sẹo phôi thu được từ môi trường tốt nhất được cấy chuyển sang môi trường tái sinh cây trên nền MS cơ bản, bổ sung BAP (1,5mg/l; 2,0mg/l; 2,5mg/l; 3mg/l; 3,5 mg/l). Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 mô, lặp lại 3 lần. Kết quả được đánh giá sau 10 đến 15 ngày cấy chuyển.
Đánh giá tỉ lệ tái sinh theo công thức:
sv r c N N R (%)
Trong đó: Rc là khả năng tái sinh cây (%) Nr là tổng số mô tái sinh cây Nsv là tổng số mô nuôi cấy
Kéo dài chồi đậu xanh
Khi chồi đạt chiều cao 2 – 2,5 cm được cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi trên môi trường MS cơ bản; muối B5 3g/l; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; GA3 với nồng độ (0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l; 2mg/l); pH 5,7. Đánh giá khả năng kéo dài chồi của cây sau 10 ngày cấy chuyển. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 chồi và lặp lại 3 lần. Chồi phát triển tốt là những chồi sau 10 ngày cấy chuyển có chiều cao đảm bảo cho cấy chuyển ra rễ, chồi mập và không bị héo ngọn.
Tạo cây hoàn chỉnh
Các chồi sau khi kéo dài được chuyển sang môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh. Môi trường ra rễ là môi trường MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; α – NAA (0,2 mg/l; 0,3 mg/l; 0,4mg/l); pH 5,6. Mỗi bình cấy từ 2- 3 chồi. Đánh giá khả năng hình thành và phát triển rễ của cây tái sinh sau 3 tuần và 4 tuần.
2.2.2. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo 2.2.2.1. Phƣơng pháp xử lý mô sẹo bằng thổi khô
Mô sẹo phôi đậu xanh sau 10 ngày nuôi cấy được đặt lên đĩa petri trải giấy lọc vô trùng và thổi khô bằng luồng khí vô trùng của buồng cấy ở các ngưỡng thời gian khác nhau, từ 0; 3; 5; 7; 9; 11 giờ. Xác định độ mất nước của mô sẹo sau 3, 5, 7, 9, 11 giờ xử lý.
Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng thổi khô được tính theo công thức: f d f L W W W W (%) Trong đó: WL:độ mất nước (%)
Wf: khối lượng mô tươi (mg)
Wd: khối lượng mô sau thổi khô (mg)
2.2.2.2. Chọn lọc mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô và tái sinh cây
Cấy mô sẹo sau khi xử lý mất nước bằng thổi khô lên môi trường tái sinh cây (MS cơ bản; đường saccharose 30g/l; thạch agar: 9g/l; 3g muối B5; BAP 3mg/l; pH: 5,7).
+ Tỷ lệ sống sót của mô sẹo được đánh giá 15 ngày thổi khô được tính theo công thức: t sv v N N S (%) Trong đó:Sv:tỷ lệ mô sống sót (%) Nsv:số mô sống sót Nt:tổng số mô xử lý
+ Tỷ lệ tái sinh cây:
sv r c N N R (%)
Trong đó: Rc:khả năng tái sinh cây (%) Nr:số mô tái sinh cây
2.2.2.3. Tạo cây hoàn chỉnh từ mô sẹo chọn lọc
Các chồi đậu xanh được tách thành một dòng cây và cấy chuyển trên môi trường tạo cây hoàn chỉnh. Nuôi 4 tuần dưới ánh sáng đền neon trong phòng nuôi cấy với cường độ 200 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ phòng nuôi 250C 10C. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh: MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; α - NAA: 0,3 mg/l; pH 5,6.
2.2.2.4. Phƣơng pháp ra cây
Cây nuôi cấy trong ống nghiệm là cây được sống trong điều kiện tối ưu về mọi mặt trong điều kiện môi trường vô trùng. Khi đưa cây ra ra ngoài ống nghiệm, cây phải chịu tác động của điều kiện bất lợi của môi trường. Do đó để đạt được cây có khả năng sống cao thì trong thời gian đầu mới đưa cây ra phải bảo vệ cẩn thận; từng bước cho cây làm quen dần với những điều kiện sống bên ngoài, cây con dần cứng cáp và phát triển được ở ngoài tự nhiên.
Các bước ra cây được tiến hành như sau:
- Các bình cây được mở nút, cho nước vào ngâm, sau đó lắc nhẹ cho thạch rời khỏi rễ cây, dùng panh cặp nhẹ kéo ra (chú ý tránh dập nát) rửa cẩn thận cho hết lớp agar bám quanh gốc bằng nước sạch.
- Chuẩn bị giá thể trồng cây: Đậu xanh kém chịu nước nên tỷ lệ đất: cát: trấu hun là 1:1,5:1,5. Giá thể trồng cây được đựng vào khay trồng với bề dày khoảng 10 cm.
- Trồng cây: cây con được trồng vào khay, sau đó dùng dung dịch MS cơ bản pha loãng 10 lần phun nhẹ nhàng vào gốc.
- Chăm sóc cây đậu xanh non: cây đậu xanh trồng trong khay để ra nơi đủ ánh sáng nhưng tránh nắng và tránh mưa trực tiếp. Sau 2 tuần cây sống ra rễ mới, lá mới có thể đưa ra ngoài vườn ươm.
2.2.3. Phƣơng pháp tạo đa chồi từ mắt lá mầm
Khử trùng hạt: hạt đậu xanh được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, sau đó rửa bằng cồn 70% trong vòng một phút, lắc hạt với dung dịch javen 60% trong vòng 20 - 25 phút, tráng sạch bằng nước cất vô trùng ba lần.
Môi trường nảy mầm hạt: Hạt đậu xanh đã được khử trùng cấy vào bình tam giác trong môi trường nảy mầm: MS cơ bản, đường saccharose 30g/l; thạch agar 9g/l; pH 5,8. Khảo sát khả năng nảy mầm của hạt, theo dõi sự phát triển và tỷ lệ nảy mầm.
Môi trường tạo đa chồi: Sau khi hạt nảy mầm dùng dao cắt bỏ phần trụ rễ cách phần mắt lá mầm khoảng 3- 4 mm. Tách đôi lá mầm thành 2 mẫu cấy, cắt bỏ lá mầm, dùng kim nhọn gây tổn thương ở mắt lá mầm. Các mảnh lá mầm được cấy trên môi trường tạo đa chồi: MS cơ bản, đường saccharose 30g/l; thạch agar: 9g/l; 3g muối B5; BAP 3mg/l; pH: 5,7. Đánh giá tỷ lệ tạo chồi và số chồi / mảnh cấy.
Môi trường kéo dài chồi: các chồi được tách riêng và cấy vào môi trường kéo dài chồi: MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; GA3 1mg/l; nước dừa 100ml/l; pH 5,7.
Môi trường ra rễ: Sau khi chồi có kích thước 4 - 5cm cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm có: MS cơ bản; đường saccharose 30g/l; thạch agar 9g/l; nước dừa 100ml/l, α - NAA0,3mg/l.
Ra cây và chế độ chăm sóc: Cây tái sinh hoàn chỉnh được ra bầu và đưa ra trồng ở ngoài (phương pháp và điều kiện ra cây giống như mục phương pháp ra cây ở mục 2.2.2)
2.2.4. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu
Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Sử dụng toán thống kê để xác định các trị số thống kê như trung bình mẫu (x), phơng sai (2), độ lệch chuẩn (), và sai số
trung bình mẫu (Sx), với n ≤ 30, α = 0,05. Các số liệu được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình Excel [16].
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. HỆ THỐNG TÁI SINH CÂY ĐẬU XANH TỪ MÔ SẸO
3.1.1. Ảnh hƣởng nồng độ các chất đến kết quả khử trùng hạt
Hạt đậu xanh được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm với cồn trong vòng một phút ở các thang nồng độ 60%; 70%; 80%; 90%. Sau đó được lắc nhẹ và đều trong dung dịch javen với nồng độ: 50%; 60%; 70% trong vòng 25 phút.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, cồn 70% và javen 60% đảm bảo cho hạt nảy mầm cao, khả năng bị nhiễm và bị thối rất thấp. Nồng độ cồn và javen thấp tỷ lệ nhiễm cao; nồng độ cồn và javen cao tỷ lệ hạt bị thối cao.
3.1.2. Ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo
3.1.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi đậu xanh
Phôi đậu xanh sau khi khử trùng được cấy lên môi trường MS cơ bản bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 phôi, lặp lại 3 lần. Theo dõi khả năng hình thành mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.1. Kết quả bảng 3.1 cho thấy, trên các loại môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau và giống đậu xanh khác nhau, phôi đậu xanh đều có khả năng tạo mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy. Ở môi trường có nồng độ 11 mg/l 2,4D thích hợp nhất cho khả năng tạo mô sẹo của phôi giống đậu xanh ĐX06, tỉ lệ mô sẹo đạt cao nhất là 100%. Còn ở môi trường có nồng độ 3mg/l – 10mg/l 2,4D tỷ lệ tạo mô sẹo thấp. Sử dụng 2,4D cao hơn 11mg/l khả năng tạo mô sẹo của phôi đậu xanh ĐX06 bắt đầu giảm. Đặc biệt với nồng độ 2,4D 13 mg/l, khả năng tạo mô sẹo giảm mạnh (79,50%). Các giống VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148;
VC6372; VC2768A, tỉ lệ mô sẹo đạt cao nhất là 99% khi sử dụng 2,4D với nồng độ 10mg/l.
Bảng 3.1. Khả năng tạo mô sẹo của các giống đậu xanh (%)
Công thức
Nồng độ
2.4D (mg/l)
VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A
1 3 85,17 86,50 80,15 81,05 87,15 82,05 87,05 81,15 2 4 86,09 86,29 83,25 81,15 86,90 83,50 86,90 81,25 3 5 86,34 87,30 86,32 86,35 87,30 87,10 87,10 85,35 4 6 89,21 87,20 86,30 87,50 87,90 87,50 87,60 84,50 5 7 92,72 91,02 87,15 89,55 90,20 88,55 90,25 89,55 6 8 95,23 91,20 93,10 94,10 91,90 94,20 91,05 90,10 7 9 96,37 93,07 97,05 95,05 94,07 94,50 92,10 92,05 8 10 99,14 98,10 99,20 97,50 98,50 97,10 99,50 95,50 9 11 94,14 97,23 96,23 100,00 96,03 96,00 96,03 92,00