Khi cây con trong ống nghiệm có kích thước 5 - 7 cm với hệ rễ phát triển được đưa ra ngoài nuôi cấy trong khay (điều kiện nuôi cấy như phương pháp ra cây mục 2.2.1). Sau khoảng 30 ngày cây đậu xanh ra hoa và kết quả.
Hình 3.13. Cây đậu xanh tái sinh được trồng trong khay (A), Cây đậu xanh tái sinh được trồng trong chậu ra hoa kết quả (B, C, D)
3.3.6. Nhận xét về môi trƣờng tái sinh từ mắt lá mầm
(1). Môi trường bổ sung 3mg/l BAP và gây tổn thương đúng vị trí trí tạo được số lượng chồi / lá mầm là cao nhất.
(2) Môi trường bổ sung 1,5 mg/l GA3 sau 10 ngày nuôi cấy chồi tạo được chồi đạt kích thước cấy chuyển ra rễ tốt nhất.
(3) Cả 8 giống đậu xanh đều có khả năng tạo đa chồi và tái sinh thành cây hoàn chỉnh, cây tái sinh đều có khả năng ra hoa kết quả khi trồng trong điều kiện trồng và chăm sóc trong khay.
A B
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
1.1. Thăm dò môi trường nuôi cấy mô sẹo đậu xanh cho thấy: môi trường có bổ sung 11mg/l 2,4D là môi trường thích hợp cho tạo mô sẹo giống đậu xanh ĐX06. Môi trường có bổ sung 10mg/l 2,4D thích hợp cho tạo mô sẹo 7 giống còn lại. Nồng độ 3mg/l BAP cho tỷ lệ tái sinh, số chồi trung bình, kích thước trung bình chồi là cao nhất và môi trường có bổ sung 0,3mg/l α-NAA là thích hợp cho tạo cây hoàn chỉnh.
1.3. Đánh giá khả năng chịu mất nước của các giống đậu xanh ở mức độ mô sẹo trên cơ sở xác định độ mất nước, khả năng chịu mất nước, khả năng sống sót và khả năng tái sinh cây đã cho thấy cả 8 giống đậu xanh đều có khả năng chịu mất nước ở mức độ mô sẹo. Đã chọn được 289 dòng mô chịu mất nước và 715 dòng cây xanh tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước.
1.3. Thăm dò môi trường tái sinh cây đậu xanh từ mắt lá mầmcho thấy, môi trường có bổ sung 3mg/l BAP và gây tổn thương đúng vị trí sẽ tạo được số chồi/ lá mầm cao. Môi trường có bổ sung 1,5 mg/l GA3 là môi trường tốt nhất để kéo dài chồi; môi trường bổ sung 0,3 mg/l α – NAA là môi trường thích hợp cho tạo rễ chồi đậu xanh.
1.4. Cả 8 giống đậu xanh đều có khả năng tạo đa chồi từ mắt lá mầm và tái sinh thành cây hoàn chỉnh, có khả năng ra hoa kết quả khi trồng ra chậu.
2. Đề nghị
2.1. Tiếp tục sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào việc chọn dòng chịu hạn từ các giống đậu xanh nghiên cứu trên.
2.2. Cần có những nghiên cứu chuyển gen thích hợp để cải tiến các giống đậu xanh có chất lượng cao và khảnăng chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường tốt.
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
Nguyễn Thị Luyện, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Lò Mai Thu, Chu Hoàng Mậu (2009), Hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro ở cây đậu xanh (Vigna radiata
(L.) Wilczek) phục vụ cho chuyển gen”. Tạp chí Khoa học&Công nghệ-Đại học Thái Nguyên, 54(6): 123-128.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, Giáo trình cao học nông nghiệp, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội (188 trang).
2. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội.
3. Lê Trần Bình, Võ Thị Ngọc Diệp, Lê Thị Muội (1995), “Nghiên cứu khả năng chịu lạnh và chịu khô ở mô sẹo lúa của các giống lúa có nguồn gốc sinh thái khác nhau”, Tạp chí sinh học, 17(1), tr. 19 – 55.
4. Bùi Bảo Hoàn (1993), Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong bảo quản, nhân giống và chọn dòng chịu lạnh ở khoai lang (Ipomoea batatas L.), Luận văn thạc sĩ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội.
5. Nguyễn Hữu Hồ và Nguyễn Văn Uyển (2005), Nghiên cứu hai kiểu tái sinh in vitro cây khoai lang Inpomoea Batatas, Những vấn đề cơ bản trong khoa học sự sống ; NXB khoa học và kỹ thuật, 1242 – 1245.
6. Nguyễn Thị Thuý Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), “Phát triển hệ thống tái sinh
in vitro ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merill) phục vụ chuyển gen”. Tạp chí Khoa học&Công nghệ-Đại học Thái Nguyên, 52(4): 82-88.
7. Ngô Thị Liêm (2006),Nghiên cứu sự đa dạng di truyền và khả năng chịu hạn của một số giống lạc (Arachis hypogaea L.), Luận văn thạc sĩ sinh học, trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên.
9. Nguyễn Hoàng Lộc (1992), Chọn dòng chịu muối NaCl và chịu mất nước ở thuốc lá (Nicotiana tabacum L.), luận án phó tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội, 107 trang.
10. Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để
tạo các dòng đậu tương và đậu xanh đột biến đột biến thích hợp cho vùng núi đông bắc Việt Nam. Luận án tiến sĩ Sinh học. Viên Công nghệ Sinh học, Hà Nội.
11. Nguyễn Thị Phương Nam và cộng sự (2007), “Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cây ngô và ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gen tạo protein giàu sắt
nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Những vấn đề cơ bản trong khoa
học sự sống, NXB Khoa học và kỹ thuật, 887 -89.
12. Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội.
13. Nguyễn Thị Thanh và Võ Phan MiSa (2007), “Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro và ứng dụng chuyển gen ở hồ tiêu; Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”, NXB Khoa học và kỹ thuật, 820 – 824.
14. Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả năng chịu nóng và chọn dòng chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội.
15. Phan Hữu Tôn (2004), Giáo trình Công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
16. Mai Trường, Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Văn Uyển (2001), “Hệ thống tái sinh cây đậu xanh từ cuống tử điệp nuôi cấy in vitro”. Tạp chí sinh học, 23: 33-35.
17. Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết quả nghiên cứu thực nghiệm trong nông lâm ng nghiệp trên máy vi tính, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội
Tài liệu tiếng anh
18. Abdul B., Frinch R. P., Cocking E. C. (1999), Plant regeneration from protoplast of wild rice (Oryza rufipogon Griff)”, Plant cell Rep, 10, pp. 200 – 203
19. Adkins S. M., Shiraishi T., Kunavuvatchaidach R.,Godwin I. D. (1995), “Somaclonal variation in rice drought – tolerance and other agronomic characters”, Aust J Bot, 4, pp. 201 – 209.
20. Amutha S., Muruganantham M., and Ganapathi A. (2006), “Thidiazuron- induced high-frequency axillary and adventitious shoot regeneration in
Vigna radiata (L.) Wilczek”. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 42:26–30. 21. Bajai S., Rajam H. (1996), “Spermidine for effcient regeneration”, Rice Bio Quar, 26, pp. 6.
22.Bertin P., Kinet J. M. Bouharmont J. (1995), “Heritable chilling tolerance improvement in rice through somaclonal variation and cell line selection”,
Aust J Bot, 44, pp. 91 – 105.
23. Bertin P., Kinet J. M. Bouharmont J. (1997), “ Somaclonal variation and improvement of chilling tolerance in rice: Chance in chilling – induce chlorophyll fluorescence”, Crop Sci, 37, pp. 1727 – 1735.
24. Biwas G. C., Zapata F. J.(1993), “High – frequence plant regeneratin from protoplast of indica rice (Oryza sativa L.) using mantose”, J plant Physiol, 141, pp. 475.
NaCl tolerance cell from embryogenesis cultures of Pennisetum purpureum Schum”, Plant Sci Lett, 37, pp. 157- 164.
26. Collin H. A., Dix P.J. (1990), “Culture systems and selection procedure. In: Plant cell line selection. VCH Verlagsgesellschaft”.
27. Dix P.J (1986), Plant cell culture technology, Yeoman M.M. (eds), Oxford, Blackwel Scientific Publication, pp. 143 – 201.
28. Dix P.J.(1990), Plant cell line selection (Procedures and Applications), VCH Verlagsgllchaft MBH
29. Gulati A. and Jaiwal P.K. (1993). “In vitro selection of salt-resistant Vigna radiata (L.) Wilczek plants by adventitious shoot formation from cultured cotyledon explants”. J. Plant Physiol. 142: 99–10.
30. Gulati A, Jaiwal PK (1994), “Plant regeneration from cotyledonary node explants of mungbean (Vigna radiata (L.) Wilczek)”. Plant Cell Rep
13:523–527.
31. Ignacimuthu S. & Franklin G. (1999), “Regeneration of plantlets from cotyledon and embryonal axis explants of Vigna mungo L. Hepper”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 55: 75–78.
32. Jayanti Sen & Spra Guha Mukherjee (1998), “In vitro intoduction of multiple shoots and plant regeneration in Vigna, In vitro Cell.Dev. Biol. plant, 34: 276 – 280.
33. K. Ramakrishnan · R. Gnanam · P. Sivakumar A. Manickam, “In vitro
somatic embryogenesis from cell suspension cultures of cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp)”,Plant Cell Rep (2005) 24: 449–461.
34. Kaviraj C.P., G. Kiran, R.B. Venugopan, P.B.Kavi Kishor, Srinath Rao (2006), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from cotyredorary
explants of green gram (Vigna radiata (L.) Wilczek)- A recalcitrant grain legume”. In vitro Cell.Der. Biol. plant. 42: 134 – 138.
35. Mundy J., Chua N. H. (1988), Abcisis and water stress induce the expression of a novel rice gene”, EMBOJ, 8, pp. 2279 – 2286.
36.Muruganantham M., Amutha S.,Selvaraj N., Vengadesan G., Ganapathi A. (2007), “Efficient Agrobacterium- ediated transformation of Vigna mungo using immature cotyledonary-node explants and phosphinothricin as the selection agent”. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant, 43:550–557.
37. Norbor M. W. (1990), Environmental stress resistance. In: Plant Cell Line Selection, Weihein, New York, Basel, Cambridge, VCH, pp. 167 – 186.
38. Prem R. anand, Ganapathi A., Ramesh V. Anbazhagan, Gengadesan G., and Selvaraj N (2001), “High frequency plant regeneration via somatic embryogenesis in cell suspension cultures of cowpea, vigna unguiculata (L.) walp”. In VitroCell. Dev. Biol-Plant, 36:475-480.
39. Poddar K., Vishnoi R. K., Kothari S. L. (1998), “Plant regeneration from embryogenesis callus”, Rice Bio quar, 35, pp. 9.
40. Raghava. R. N. V., Nabors M. V., (1985), “Plant negeneration from tissue cultures of Pokali rice is promoted by optizing callus to medium volume ratio and by a medium conditioning factor produced by embryogeneic callus”, Cell Tiss Org Cult, 4, pp. 241 – 248.
41. Rudrabhatla Sairam, Siva Chennareddy, Madasamy Parani, Shulu Zhang, Diaa Al-abed, Wissam Abou-Alaiw, and Stephen Goldman (2005), “Obpc symposium: Maize 2004 & beyond – plant regeneration, gene discovery, and genetic engineering of plants for crop improvement”. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 41:411–423.
regeneration response from cotyledonary node explants in Asiatic Vigna species support genomic grouping within subgenus Ceratotropis (Piper) Verdc.” Plant Cell, Tissue and Organ Culture 58: 99–110.
43. Renato A Avenido, Jo Motoda and Kazumi Hattori (2001), “Direct shoot regeneration from cotyledonary nodes as a marker for genomic groupings within the Asiatic Vigna (subgenus Ceratotropis {Piper} Verdc.) species”.
Plant Growth Regulation, 35: 59–67.
44. Sita L. Mahala, T. Leela, B. Kiran Kumar, B. Naresh, Prathibha Devi (2006), “In vitro plant regeneration from the petioles of primary leaves of mungbean (Vigna radiata L.)”. Plant Biotechnology, 23: 409–411.
45. Sonia, Raman Saini, Rana P. Singh, Pawan K. Jaiwal (2007), “Agrobacterium tumefaciens mediated transfer of Phaseolusvulgaris - amylase inhibitor-1 gene into mungbean (Vigna radiata (L.)Wilczek) using bar as selectable marker”. Plant Cell Rep 26:187–198