Quy trình thiết kết mồi đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau. i) Thu thập các trình tự gen quan tâm từ Ngân hàng gen (GenBank); ii) Sử dụng các phần mềm thiết kết primer chuyên dụng nhƣ Primer3 để thiết kế các đoạn primer đặc hiệu cho các đoạn gen quan tâm.
i) Thu thập các trình tự gen quan tâm từ GenBank:
Trƣớc khi thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho gen và các trình tự cần phân lập của các chủng virut nghiên cứu (Ví dụ: trình tự gen CP của RGSV), trình tự đoạn gen này đƣợc thu thập từ GenBank tại địa chỉ www.ncbi.nlm.nih.gov [63]. Trình tự của các đoạn gen quan tâm có thể tìm kiếm thông qua tên của gen hoặc số hiệu của gen đƣợc đăng kí trong ngân hàng gen. Sau khi có đƣợc trình tự của gen quan tâm, các đoạn primer sẽ đƣợc thiết kế bằng việc sử dụng các chƣơng trình thiết kế.
ii) Sử dụng các phần mềm thiết kết primer chuyên dụng nhƣ Primer3 để thiết kế các đoạn primer đặc hiệu cho các đoạn gen quan tâm. Chƣơng trình Primer3 đƣợc đăng kí tại địa chỉ http://www.bioinformatics.nl/cgi- bin/primer3plus/primer3plus.cgi [67].
Trong quá trình thiết kế mồi cần căn cứ vào một số điểm sau: Mồi phải có độ đặc hiệu và hiệu suất khuếch đại cao. Cố gắng chọn trình tƣ̣ mồi có khoảng 50% GC khi đó Tm trong khoảng 56- 620C sẽ tạo điều kiện để quá trình ủ đạt kết quả tốt. Tránh G và C ở đầu 3’ của mồi vì nó có thể làm tăng cơ hội tạo ra hiện tƣợng primer-dimers (hai primer bắt cặp với nhau ). Tránh chọn các vùng có trình tự tƣơng đồng để hạn chế các mồi tƣ̣ gắn với nhau . Tính toán nhiệt độ nóng chảy (Tm) của primer với tổng số 40
C cho GC và 20
C cho AT theo công thức Tm = 4(G+C) + 2(A+T), sau đó trƣ̀ đi 50C tƣ̀ giá trị này và đây chính là nhiệt độ ủ (Ta) của primer [30], [39].