Tách dòng gen là một công cụ hữu hiệu đƣợc sử dụng trong kỹ thuật di truyền và là bƣớc khởi nguồn cho các kỹ thuật sau này. Mục đích của việc tách dòng là nhằm thu đƣợc một lƣợng lớn bản sao của trình tự gen quan tâm. Đầu tiên, DNA ngoại lai đƣợc nối vào một vectơ nhằm tạo ra DNA tái tổ hợp. Vectơ sử dụng là plasmit thích ứng của vi khuẩn E.coli. Sau đó, vectơ tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào chủ và tế bào chủ đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng thích hợp để nhân vi khuẩn lên nhiều lần. Tế bào chủ ở đây là vi khuẩn E.coli. Cuối cùng qua các bƣớc tách chiết DNA, ngƣời ta sẽ thu đƣợc một lƣợng lớn plasmit tái tổ hợp.
Các nhân tố nhƣ vectơ, tế bào chủ có thể thay đổi nhƣng tiến trình tách dòng nói chung đƣợc thực hiện qua 4 bƣớc: xử lý DNA cần tạo dòng, tạo vectơ tái tổ hợp, biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ, chọn dòng.
- Xử lý DNA cần tạo dòng
Trƣớc hết DNA cần tạo dòng đƣợc khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc làm sạch để thu đƣợc phân đoạn DNA có kích thƣớc nhƣ mong muốn, loại bỏ mồi và các thành phần khác trong phản ứng PCR. Bƣớc này nhằm tạo điều kiện cho bƣớc chọn dòng đƣợc thực hiện nhanh và hiệu quả, tránh những plasmit tái tổ hợp có kích thƣớc không mong muốn.
- Tạo vectơ tái tổ hợp
Vectơ tái tổ hợp đƣợc tạo ra bằng cách gắn gen quan tâm (đoạn DNA cần tạo dòng) vào vectơ tách dòng. Thông thƣờng, sau khi chạy PCR với enzym Taq- polymerase, enzym này sẽ gắn thêm một nucleotit là Adenin vào đầu 3’ của đoạn gen đƣợc nhân lên. Lợi dụng tính chất này, các nhà khoa học đã nghiên cứu, thiết kế các thế hệ vectơ tách dòng có mang 1 nucleotit là Thymin ở đầu 5’ của vectơ đã đƣợc mở vòng sẵn tại PCS (polycloning site- vùng nhân dòng đa điểm cắt). Hiện nay, có rất nhiều vectơ tách dòng có điểm cắt này, nhƣ pBT, pCR®
2.1- TOPO, pGEM®-T...
Vectơ tách dòng và DNA cần tạo dòng đƣợc trộn chung theo một tỷ lệ nhất định dƣới sự xúc tác của enzym T4 ligase, DNA sẽ đƣợc gắn vào vectơ theo nguyên tắc bổ sung A – T tại vị trí mở vòng.
- Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ
Trong quá trình gắn gen vào vectơ sẽ hình thành nên các vectơ tái tổ hợp khác nhau. Bƣớc này nhằm sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vectơ tái tổ hợp thành một số lƣợng lớn bản sao.
- Chọn dòng
Chọn dòng vi khuẩn tái tổ hợp theo hai cách thông dụng: chọn lọc theo phƣơng pháp kháng sinh (kanamycin, ampicillin,...) nhằm loại trừ các tế bào vi khuẩn không đƣợc biến nạp và các loại vi khuẩn nhiễm tạp khác và chọn lọc theo phản ứng với cơ chất (X-gal) nhằm loại trừ những vi khuẩn có mang vectơ nhƣng không có đoạn gen nào đƣợc gắn vào.