2.2.1.1. Phƣơng pháp pha môi trƣờng nuôi cấy
- Nguyên tắc: Pha môi trường đặc với thành phần và nồng độ các chất phù hợp. Môi trường là WPM có đầy đủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin, tất cả các hoá chất tan đều, không kết tủa. Môi trường có bổ sung chất độn là agar để làm giá đỡ, yêu cầu không quá lỏng cũng không quá rắn để cấy mẫu được dễ dàng. Ngoài ra, chúng tôi còn bổ sung nước dừa vào môi trường để tăng nguồn cung cấp dinh dưỡng cho cây. Khử trùng môi trường theo phương pháp khử trùng Pasteur. Dụng cụ pha môi trường được rửa sạch, sấy khô.
- Các bước tiến hành: Sau khi xác định được công thức cần pha, tính thể tích các hoá chất trong môi trường nuôi cấy.
Ví dụ, môi trường nhân chồi dẻ có công thức WPM + đường sucrose 25g/l + agar 8,5g/l + BAP 0,5mg/l + nước dừa 200ml/l, có thể tiến hành theo các bước sau:
(2) Dùng pipet hoặc ống đong lấy các dung dịch WPM với nồng độ WPM1: 20ml/l; WPM2: 20ml/l; WPM3: 5ml/l; WPM4: 5ml/l; WPM5: 5ml/l. Cho tất cả vào 1 cốc thuỷ tinh sạch.
(3) Bổ sung 1ml BAP vào cốc dung dịch trên. (4) Cân 20g đường sucrose và 8,5g thạch agar.
(5) Khi nước sôi, cho đường vào khuấy tan rồi đổ agar vào khuấy đều và đun sôi cho tan hết.
(6) Bổ sung hoá chất đã chuẩn bị ở cốc thuỷ tinh.
(7) Định lượng dung dịch trên bằng nước cất đến 1000 ml. Điều chỉnh pH bằng máy chuẩn pH sao cho pH đạt 5,7 - 5,8.
(8) Chia đều vào các bình tam giác mỗi bình khoảng 75ml. Sau đó nút bông và đóng bằng nắp giấy đậy kín.
(9) Khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 120 - 121oC, thời gian 20 phút, áp suất 1 - 1,2atm. Sau khi khử trùng, để môi trường ổn định sau 1 - 2 ngày có thể sử dụng.
2.2.1.2. Phƣơng pháp khử trùng mẫu hạt dẻ và đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy
* Mục đích:
Thu được vật liệu sạch phục vụ cho các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo.
* Các bƣớc tiến hành:
Mẫu hạt nuôi cấy được làm sạch bằng cách:
+ Khử trùng hạt ngoài buồng nuôi cấy: Hạt đã được bóc hết 2 lớp vỏ cứng và vỏ gai được cắt bỏ bớt phần thịt hạt không chứa mầm. Rửa sạch bằng nước cất, sau đó rửa sạch bằng xà phòng và tráng lại bằng nước cất.
+ Khử trùng hạt trong buồng cây: Hạt được đưa vào môi trường nuôi cấy vô trùng, tiếp tục được khử trùng bằng javen và cồn với thời gian khác nhau. Chúng tôi sử dụng cồn 70o trong thời gian 2 phút, 5 phút, 7 phút, 10
phút và javen 65% trong 20 phút và 25 phút. Sau đó, tráng lại hạt 3 - 5 lần bằng nước cất vô trùng. Thấm khô hạt bằng giấy thấm đã khử trùng.
Mẫu hạt đã làm sạch được cấy vào các bình tam giác trong buồng cấy đã được khử trùng bằng tia cực tím.
Công thức môi trường cấy gây được sử dụng là: WPM + đường sucrose 25g/l + agar 8,5g/l + nước dừa 200ml/l. Theo dõi tỉ lệ hạt nảy mầm tỉ lệ hạt nhiễm và chết sau 4 tuần. Những hạt nảy mầm được chăm sóc và theo dõi đến khi mầm dài 5cm - 7cm có thể chuyển sang môi trường nhân chồi.
2.2.1.3. Phƣơng pháp nhân chồi Mục đích:
Thăm dò và xác định ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng có trong môi trường nuôi cấy đến khả năng phát sinh chồi.
Cách tiến hành:
Các chồi có kích thước từ 5cm - 7cm thu được trên môi trường cấy gây được chuyển sang môi trường nuôi cấy đối chứng (không bổ sung chất kích thích sinh trưởng, chỉ có WPM + đường sucrose 25g/l + agar 8,5g/l + nước dừa 200 ml/l) và môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng (WPM + đường sucrose 25g/l + agar 8,5g/l + nước dừa 200ml/l + kích thích sinh trưởng).
Các chất kích thích sinh trưởng được bổ sung vào môi trường với nồng độ như sau: BAP (0,2mg/l; 0,5mg/l; 1mg/l; 1,2mg/l; 1,5mg/l), tổ hợp BAP (0,2mg/l; 0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l) + kinetin (0,5mg/l; 1mg/l; 1,2mg/l; 1,3mg/l; 1,5mg/l; 2mg/l), tổ hợp BAP (0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l) + NAA (0,05mg/l; 0,1mg/l; 0,2mg/l; 0,3mg/l; 0,4mg/l).
Quan sát, theo dõi và thu thập số liệu về các chỉ tiêu: tỉ lệ mô tạo chồi, số chồi/mô, chiều cao và màu sắc chồi. Kết quả được phân tích trên phần mềm exel và đánh giá dựa trên số liệu thu được.
2.2.1.4. Phƣơng pháp tạo cây hoàn chỉnh
Các chồi có kích thước từ 5cm - 7cm được cắt thành các đoạn khoảng 2cm - 3cm và chuyển sang môi trường tạo rễ. Thành phần môi trường gồm có: WPM + đường sucrose 25g/l+ agar 8,5g/l + nước dừa 200ml/l+ α - NAA (0,05mg/l; 0,1mg/l; 0,2mg/l; 0,3mg/l; 0,4mg/l). Theo dõi, thu thập số liệu và phân tích kết quả về các chỉ tiêu: tỉ lệ cây tạo rễ, số rễ/cây và kích thước rễ trong 8 tuần.
2.1.1.5. Phƣơng pháp đƣa cây ra ngoài môi trƣờng tự nhiên
Đây là khâu cuối cùng của quy trình nhân giống bằng phương pháp in - vitro nhằm tìm giá thể tốt nhất cho cây dẻ để đưa chúng ra môi trường tự nhiên.
Chúng tôi đã thử nghiệm trồng cây dẻ con trên 3 loại giá thể là đất, trấu hun, và hỗn hợp đất + trấu hun. Theo dõi và chăm sóc trong 8 tuần, thu thập số liệu và phân tích đánh giá kết quả.
2.1.1.6. Phƣơng pháp tính toán kết quả
Sau khi tiến hành nuôi cấy và theo dõi kết quả, số liệu thu thập được được phân tích trên phần mềm exel của Chu Văn Mẫn [20] các giá trị thống kê về giá trị trung bình (X ), sai số trung bình mẫu (mx)...