bằng kĩ thuật RAPD
2.2.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA
Nguyên tắc: Tách được DNA ra khỏi các sản phẩm của tế bào và chiết xuất DNA đảm bảo giữ nguyên cấu trúc và độ tinh sạch.
Tiến hành:
Lá của 5 mẫu dẻ được thu thập, bảo quản lạnh ở - 85oC, tách chiết và tinh sạch DNA theo phương pháp của Doyle J.J có cải tiến [40], gồm các bước sau:
-Cân 200mg mẫu lá non cho vào ống eppendorf 2 ml.
- Cho nitơ lỏng vào ống eppendorf có chứa mẫu lá. Nghiền bằng đũa thủy tinh có đầu nhọn vừa với ống eppendorf thành dạng bột mịn.
- Bổ sung 800µl đệm tách DNA, đảo nhẹ để tạo thành hỗn hợp đồng nhất, ủ trong 60 phút ở 650
C.
- Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Bổ sung 800µl hỗn hợp Chloroform : Isoamyl (24:1), đảo đều.
- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút để phân tách thành 2 pha, hút cẩn thận dịch nổi cho vào ống eppendorf mới.
- Tủa dịch nổi bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1), đảo nhẹ.
- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút loại bỏ dịch nổi (hoặc vớt kết tủa DNA).
- Rửa DNA hai lần bằng ethanol 80%.
- Làm khô DNA bằng máy Speed - Vac hay ở nhiệt độ phòng. - Hoà tan DNA trong 300µl TE 1X.
- Bổ sung 1µl RNase (10mg/ml), ủ ở 370C trong 30 phút. - Thêm 10µl Sodium acetate 3M đảo nhẹ.
- Bổ sung 2,5 thể tích ethanol tuyệt đối, đảo nhẹ để ở - 200C ít nhất 1 giờ. - Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi.
- Rửa DNA hai lần bằng ethanol 80%.
- Hoà tan DNA trong 300µl TE 1X, giữ ở -200C đến khi sử dụng.
DNA sau khi tách chiết được kiểm tra trên gel agarose 0,8%, xác định hàm lượng trên máy đo quang phổ và pha loãng về nồng độ sử dụng 10 ng/μl.
2.2.2.2. Phản ứng PCR - RAPD
Mỗi ống phản ứng PCR có 25μl dung dịch chứa 1X đệm PCR; 2,5mM MgCl2; 100μl 4 dNTPs; 200nM đoạn mồi; 0,125 đơn vị Taq polymerase và 10ng DNA khuôn.
Phản ứng PCR - RAPD thực hiện trong máy PCR - Thermal Cycler PTC 100 theo chu trình nhiệt: Bước 1: 94oC trong 3 phút; Bước 2: 92o
C trong 1 phút; Bước 3: 35oC trong 1 phút; Bước 3: 72oC trong 1 phút, từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 45 chu kì; Bước 5: 72oC trong 10 phút; Bước 6: giữ ở 4o
C. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,8%, nhuộm Ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel.
2.2.2.3. Phân tích số liệu
Phân tích số liệu theo quy ước: 1 = phân đoạn đa hình xuất hiện và 0 = phân đoạn đa hình không xuất hiện khi điện di sản phẩm RAPD với các đoạn mồi ngẫu nhiên.
Xác định hệ số di truyền giống nhau theo phương pháp của Nei Và Li (1979) - hệ số Jacar [41]. c b a a Sij 2 2
Trong đó: Sij: Hệ số giống nhau giữa 2 cá thể
a: Số phân đoạn DNA xuất hiện ở cả 2 cá thể i và j
b: Số phân đoạn DNA xuất hiện ở i và không xuất hiện ở j
c: Số phân đoạn DNA xuất hiện ở j và không xuất hiện ở i
Phân tích đánh giá hệ số tương quan kiểu hình theo 3 phương pháp: SM, Dice and Jaccard và 4 phương pháp phân nhóm UPGMA (phân tích các nhóm phân tử không cùng trọng lượng), WPGMA (phân tích các nhóm phân tử có cùng trọng lượng), liên kết hoàn toàn (complete linkage), liên kết đơn lẻ (single linkage). Lập biểu đồ hình cây dựa vào giá trị phân tích của giá trị tương quan kiểu hình cao nhất trong chương trình NTSYS 2.1. Hàm lượng thông tin tính đa hình (Polymorphism Information Content = PIC) của mỗi cặp mồi xác định theo công thức:
PICi = 1 - ∑P1
2
Trong đó: Pi là tần số của alen i của kiểu gen được kiểm tra
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN