Phƣơng pháp hóa sinh

2.2.2.1. Phương pháp phõn tích hóa sinh ở giai đoạn hạt tiờ̀m sinh

(1) Xỏc định hàm lượng protein : Hàm lƣợng protein tan đƣợc xỏc định theo phƣơng pháp Lowry đƣợc mụ tả trong tài liợ̀u của Phạm Thị Trõn Chõu và Cs (1997) [3].

Hạt thóc đƣợc bóc vỏ, nghiền mịn, sấy đến khụ tuyệt đối ở 1050

C. Cõn 0,05g mẫu cho vào eppendorf, thờm 1,5 ml đệm chiết phostphat citrat pH=10, lắc đều bằng voltex 10 phỳt, để qua đờm ở nhiệt độ 40

C, đem ly tõm 12000 vũng/phỳt ở 40 C trong 30 phỳt, rụ̀i thu lṍy dịch đờ̉ làm thí nghiợ̀m. Thớ nghiệm lặp lại 3 lõ̀n.

Dịch chiờ́t đƣợc định mức lờn 5ml bằng dung dịch đợ̀m ph osphat citrat (pH=10) và đo phụ̉ hấp thụ trờn mỏy U Vvis Cintra ở bƣớc sóng 750nm với thuốc thử foling.

Hàm lƣợng protein đƣợc tính theo cụng thƣ́c : X (%) = A HSPL

m

 

100 % (2.1) Trong đó: X: hàm lƣợng protein (% khụ́i lƣợng khụ)

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

HSPL: hợ̀ sụ́ pha loãng m: khụ́i lƣợng mõ̃u (mg)

(2) Xỏc định hàm lượng đường tan : Hàm lƣợng đƣờng đƣợc xỏc định theo phƣơng phỏp vi phõn tớch đƣợc mụ tả trong tài liệu của Phạm Thị Trõn Chõu và Cs (1997) [3].

Mõ̃u đƣợc bóc vỏ, sṍy khụ tuyợ̀t đụ́i ở 1050

C. Cõn 0,5g mẫu nghiền trong 4ml nƣớc cất. Ly tõm 12000 vũng/phỳt ở 40

C trong 30 phỳt, thu dịch. Hàm lƣợng đƣờng tan đo phụ̉ hṍp thụ ở bƣớc sóng 585 nm. Hàm lƣợng đƣờng tan đƣợc tớnh dựa trờn đụ̀ thị đƣờng chuõ̉n glucose.

Tớnh kết quả tính theo cụng thƣ́c:

X (%) = a b HSPL m

 

(%) (2.2)

Trong đó: X: hàm lƣợng đƣờng tan (% khụ́i lƣợng chṍt khụ) a: mật độ quang đo đƣợc trờn mỏy ở bƣớc súng 585nm

b: số ml dịch chiết HSPL: hệ số pha loóng m: khối lƣợng mẫu (mg)

(3) Phương pháp xác định thành phõ̀n axit amin

Hàm lƣợng axit amin đƣợc xỏc định trờn mỏy HP - Amino Quant sƣ̉ dụng ortho- phtalandehyt tạo dõ̃n xuṍt đụ́i với các axit amin bọ̃c 1 và 9 – fluoreryl- metyl- clorofomat đụ́i với các axit amin bọ̃c 2. Mõ̃u đƣợc xƣ̉ lý theo phƣ ơng pháp thủy phõn pha lỏng theo hƣớng dõ̃n sƣ̉ dụng máy phõn tích axit amin tƣ̣ đụ̣ng.

2.2.2.2. Đánh giá khả năng chịu hạn sinh lý thụng qua phõn tích mụ̣t sụ́ chỉ tiờu sinh hóa ở giai đoạn hạt nảy mõ̀m

(1) Chuõ̉n bị mõ̃u: Hạt của cỏc giống lỳa nghiờn cứu sau khi xử lý nhiệt 350 C trong 10 phỳt, ngõm nƣớc trong 24h sau đó ủ trong dung dịch MS chứa sorbitol 5 %. Hạt nẩy mầm sau cỏc thời gian ủ 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày đƣợc lṍy đờ̉ xác định hoạ t đụ̣ của enzym protease và hàm lƣợng protein tan , hoạt độ của enzym - amylase và hàm lƣợng đƣờng tan.

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

(2) Xỏc định hoạt đụ̣ của enzym - amylase

Xỏc định hoạt độ enzym - amylase theo phƣơng phỏp của Heilken đƣợc mụ tả trong tài liệu của Nguyờ̃n Lõn Dũng (1979) [10].

Hoạt độ enzym - amylase đƣợc xác định dƣ̣a trờn lƣợng tinh bụ̣t bị enzym thủy phõn trong thời gian 30phỳt ở 300

C. Giỏ trị mật độ quang đƣợc đo ở bƣớc sóng 560nm trờn máy quang phụ̉ UVvis Cintra 40.

Nguyờn tắc : Dựa vào tớnh chất hũa tan của enzym - amylase trong dung dịch đệm phosphat 0,2 M pH = 6,8.

Hạt thóc nõ̉y mõ̀m bóc vỏ , cõn khụ́i lƣợng, nghiờ̀n trong đợ̀m phosphat 0,2M pH = 6,8, ly tõm 12000 vũng/phỳt trong 15 phỳt ở 40C, thu dịch đờ̉ xác định hoạt đụ̣ của enzym. Thớ nghiệm phõn tớch hoạt độ enzym - amylase đƣợc tiến hành với ống thớ nghiệm và ống kiểm tra , cơ chất là tinh bột 1% đo trờn máy quang phụ̉ ở bƣớc sóng 560nm. Hoạt độ của enzym - amylase đƣợc tính dƣ̣a trờn đụ̀ thị đƣờng chuõ̉n xõy dƣ̣ng bằng tinh bụ̣t.

Hoạt độ enzym - amylase đƣợc tớnh theo cụng thức:

A (ĐVHĐ/ mg) = (C2 C )1 HSPL h

 

(2.3)

Trong đó: A: hoạt độ enzym - amylase (ĐVHĐ/mg)

C2: lƣợng tinh bụ̣t còn lại của mõ̃u thí nghiợ̀m (mg/ml) C1: lƣợng tinh bụ̣t còn lại của mõ̃u kiờ̉m tra (mg/ml) h: khụ́i lƣợng mõ̃u (mg)

HSPL: hợ̀ sụ́ pha loãng

Định tớnh hoạt đụ̣ enzym - amylase :

Thành phần hỗn hợp dịch: Thạch agar 2%, tinh bột 1% và nƣớc cất. Cho hỗn dịch vào bỡnh tam giác đun cỏch thuỷ cho tan thạch , đổ vào đĩa petri dày 4mm để nguội, đục lỗ đƣờng kớnh 9mm. Nhỏ 100àl dịch chiết chứa enzym vào mỗi lỗ, để tủ lạnh qua đờm để enzym khuyếch tỏn, chuyển sang tủ ấm ở 300

C trong 24giờ. Nhuộm bằng lugol 5phỳt và trỏng lại bằng NaCl 1N.

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hàm lƣợng đƣờng tan đƣợc xỏc định nhƣ mụ tả ở mục 2.2.2.1

(4) Xỏc định hoạt đụ̣ enzym protease

Hoạt độ enzym protease xác định theo phƣơng pháp Anson theo mụ tả của Nguyờ̃n Văn Mùi (2001) [36].

Hạt thóc nõ̉y mõ̀m bóc vỏ , cõn khụ́i lƣợng , nghiờ̀n trong đợ̀m phosphat (pH=6,5), ly tõm 12000 vũng/phỳt trong 15 phỳt ở 40C, dịch thu đƣợc sử dụng làm thớ nghiệm . Thớ nghiệm phõn tớch hoạt độ enzym protease đƣợc tiến hành với ống thớ nghiệm và ống kiểm tra đo trờn máy quang phụ̉ ở bƣớc sóng 750nm. Hoạt độ của enzym protease đƣợc tính dƣ̣a trờn đụ̀ thị đƣờng chuõ̉n xõy dƣ̣ng bằng tyrozin . Hoạt độ enzym protease tính theo cụng thƣ́c:

(n k) D HSPL ĐVHĐ/ mg T m      (2.4)

Trong đó: n: Chỉ sụ́ đo đƣợc ở bƣớc song 750nm của ống thớ nghiệm (mg/ml) k: Chỉ sụ́ đo đƣợc ở bƣớc song 750nm của ống kiờ̉m tra (mg/ml) D: sụ́ ml dịch chiờ́t

HSPL: hợ̀ sụ́ pha loãng m: khụ́i lƣợng mõ̃u (mg)

T: thời gian ủ enzym với cơ chṍt (phỳt)

Định tớnh hoạt đụ̣ enzym protease: Tiờ́n hành tƣơng tƣ̣ nhƣ định tính hoạt đụ̣ enzym - amylase, cơ chṍt là gelatin 1%.

(5) Xỏc định hàm lượng protein tan

Hàm lƣợng protein tan đƣợc xác định nhƣ mụ tả ở mục 2.2.2.1.

2.2.3. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn mạ bằng phƣơng pháp gõy hạn nhõn tạo

Phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn mạ đƣợc tiờ́n hành theo Lờ Trõ̀n Bình và Cs (1998) [1].

Hạt lỳa nảy mầm gieo vào cỏc bỏt nhựa nhỏ có kớch thƣớc bằng nhau , mụ̃i hụ̣p 50 hạt. Cỏt vàng đói sạch , phơi khụ cho vào các hụ̣p với lƣợng nhƣ nhau . Thớ nghiợ̀m đƣợc lặp lại 3 lõ̀n cho mụ̃i chỉ tiờu nghiờn cƣ́u trong điờ̀u kiợ̀n chăm sóc nhƣ

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

nhau. Thời gian đõ̀u tƣới nƣớc cho đủ õ̉m , khi cõy đƣợc 3 lỏ thật thỡ tiến hành gõy hạn nhõn tạo và đỏnh giỏ khả năng chịu hạn của cỏc giống lỳa . Theo dõi các chỉ tiờu liờn quan đờ́n khả năng chịu hạn trƣớc và sau khi gõy hạn nhƣ sau:

(1) Khụ́i lƣợng tƣơi của rờ̃, thõn lá.

(2) Khụ́i lƣợng khụ của rờ̃ , thõn lá các mõ̃u đƣợc sṍy khụ tuyợ̀t đụ́i ở 1050C đến khi khối lƣợng khụng đổi.

(3) Xỏc định khả năng giữ nƣớc qua cỏc giai đoạ n xƣ̉ lý bởi hạn . Khả năng giƣ̃ nƣớc đƣợc tính theo cụng thƣ́c:

100 (%) x W W W kxl xl  (2.5)

Trong đó: W: khả năng giữ nƣớc của cõy sau khi xử lý hạn (%) Wxl : khụ́i lƣợng tƣơi của cõy sau khi xƣ̉ lý hạn (g) Wkxl : khụ́i lƣợng tƣơi của cõy khụng xử lý hạn (g) (4) Xỏc định chỉ số chịu hạn tƣơng đối của cỏc giống theo cụng thức:

1

S sin (an.bn+bn.cn+ cn.dn +dn.en+...+ kn.an) 2

  (2.6)

Trong đó: S : chỉ số chịu hạn tƣơng đối

: là góc tạo bởi hai trục mang trị số liền nhau  = 3600/9 a,b,c,d….k là các chỉ tiờu theo dõi

n : kớ hiệu cỏc giống nghiờn cứu.

(5) Xỏc định tỷ lệ thiệt hại do hạn gõy ra đƣợc theo cụng thức:

0

n b

TH (%)

nc

 (2.7)

Trong đó: TH: tỷ lệ thiệt hại do hạn gõy ra (%) b: trị số thiệt hại mỗi cấp

n0: sụ́ cõy của mụ̃i cṍp thiợ̀t hại c: trị số thiệt hại của cấp cao nhất n: tụ̉ng sụ́ cõy xƣ̉ lý

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

(6) Xỏc định hàm lƣợng prolin

Xỏc định hàm lƣợng prolin theo phƣơng pháp của Bate L.S. và cộng sự (1973) [67].

* Chuẩn bị mẫu: Tiến hành tƣơng tự mục 2.2.3.

* Tiến hành tỏch chiết prolin: Rờ̃, thõn lá của các giụ́ng ở các thời điờ̉m 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày gõy hạn , cõn khụ́i lƣợng 0,3 gram mẫu. Thờm 10ml dịch chiờ́t axit sunfosalisilic 3 %, ly tõm lạnh 7000 vũng/phỳt trong 20 phỳt và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml dịch chiết cho vào bỡnh, bổ sung 2ml axit axetic và 2ml dung dịch ninhidrin, sau đó ủ trong nƣớc nóng 1000C trong 1 giờ, ủ trong tủ đỏ 5 phỳt. Bổ sung vào bỡnh 4ml toluene, lắc đều và lấy phần dịch có màu hồng ở trờn. Đo phổ hṍp thụ ở bƣớc sóng 520nm. Hàm lƣợng prolin đƣợc xỏc định trờn mỏy theo đồ thị chuẩn.

Hàm lƣợng prolin đƣợc tính theo cụng thƣ́c:

(%) AxHSPL 100

X x

m

 (2.8)

Trong đó: X: hàm lƣợng prolin (%)

A: nụ̀ng đụ̣ thu đƣợc khi đo trờn máy quang phụ̉ HSPL: hợ̀ sụ́ pha loãng

m: khụ́i lƣợng mõ̃u (mg)

2.2.4. Phƣơng pháp nuụi cṍy in vitro 2.2.4.1. Tạo mụ sẹo từ hạt lỳa

- Khử trùng hạt

Hạt lỳa đƣợc bóc vỏ trấu và khử trựng 1 phỳt trong cồn 700

, 25 phỳt trong nƣớc giaven 60%, lắc nhẹ, rƣ̉a sạch bằng nƣớc cṍt vụ trùng 3 - 5 lõ̀n, sau đó chuyờ̉n hạt lờn đĩa petri có trải giấy lọc vụ trựng.

- Tạo mụ sẹo

Hạt gạo đó khử trựng đƣợc cấy vào mụi trƣờng (MS) cơ bản [42] bụ̉ sung 2mg 2,4D, 3% saccharose, 0,9% agar, pH=5,8. Nuụi 1 tuõ̀n trong tụ́i , 2 tuõ̀n dƣới

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

ỏnh sỏng đốn trong phũng nuụi cấy với cƣờng độ 2000lux, thời gian chiờ́u sáng 8/24 giờ, nhiợ̀t đụ̣ 250

C ± 10C.

Đánh giá tỉ lợ̀ tạo mụ sẹo sau 3 tuõ̀n nuụi cṍy của cỏc giống theo cụng thức: Ci (%)=

Ncp

X 100 (2.9) Nt

Trong đó : Ci: Tỷ lệ tạo mụ sẹo (%) Ncp: Số hạt tạo mụ sẹo Nt: Tổng số hạt nuụi cấy

2.2.4.2. Phương pháp xử lý thụ̉i khụ mụ sẹo

Mụ sẹo sau 3 tuõ̀n nuụi đƣợc cắt thành nhƣ̃ng khụ́i mụ có kích thƣớc khoảng 3mm x 3mm. Đặt những khối mụ này lờn đĩa petri có lót giấy vụ trựng và thổi khụ bằng luụ̀ng khí vụ trùng của box cṍy ở các ngƣỡng thời gian khác nhau . Xỏc định đụ̣ mṍt nƣớc của mụ sẹo sau 2, 4, 6 và 8 giờ xƣ̉ lý thụ̉i khụ liờn tục.

Độ mất nƣớc của mụ sẹo sau khi xử lý thổi khụ đƣợc tớnh theo cụng thức: WL (%)=

Wf - Wd

x 100 (2.10) Wf

Trong đó : WL: Độ mất nƣớc (%)

Wf: Khối lƣợng mụ tƣơi (mg)

Wd: Khối lƣợng mụ sau thụ̉i khụ (mg)

2.2.4.3. Chọn lọc mụ sẹo sụ́ng sót sau xử lý và tỏi sinh cõy

Cṍy mụ sẹo sau khi xử lý mất nƣớc lờn mụi trƣờng tỏi sinh cõy (MS cơ bản + 2% saccharose + 0,8% agar + 1 mg/l kinetin + 0,2mg/l NAA, pH=5,8). Mọ̃t đụ̣ cṍy 20 mụ/bỡnh. Nuụi dƣới ánh sáng đèn neon trong phòng nuụi cṍy với cƣờng đụ̣ 2000lux, thời gian chiờ́u sáng 8/24 giờ. Nhiợ̀t đụ̣ phòng nuụi 250C ± 10C.

Tỷ lệ mụ sẹo sống sót đƣợc đỏnh giỏ sau 3 tuõ̀n nuụi theo cụng thƣ́c: Sv (%)=

Nvs

x 100 (2.11) Nt

Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn

Trong đó: Sv: Tỷ lệ mụ sống sót (%) NSV: Sụ́ mụ sụ́ng sót Nt: Tụ̉ng sụ́ mụ xƣ̉ lý

Tỷ lệ tỏi sinh cõy đƣợc đỏnh giỏ sau 6 tuõ̀n nuụi theo cụng thƣ́c: RC (%) = Nr x 100 (2.12)

NSV Trong đó: Rc: Tỷ lệ tỏi sinh

Nsv: Sụ́ mụ sụ́ng sót Nr: Sụ́ mụ tái sinh cõy

2.2.4.4. Xỏc định nhanh sức sống của tờ́ bào và mụ bằng phƣơng pháp nhuụ̣m TTC

Hạt của 6 giụ́ng lúa đƣợc sƣ̉ dụng làm nguyờn liợ̀u tạo mụ sẹo nhƣ mục 2.2.2.1. Sau đó tiờ́n hành xƣ̉ lý thụ̉i khụ ở ngƣỡng thời gian 4 giờ.

Xỏc định sức sống của tế bào mụ sẹo bằng p hƣơng pháp nhuụ̣m TTC theo Towill và CS (1975) [89]. Cõn 0,6 gam TTC pha loãng trong 25ml nƣớc cṍt. Dung dịch MS pha loóng 10 lõ̀n. Cõn 30 mg mụ sẹo cho vào ụ́ng nghiợ̀m , thờm 0,5ml dung dịch MS pha loãng 10 lõ̀n và 0,25ml dung dịch TTC , để 12 giờ trong tụ́i ở nhiợ̀t đụ̣ 250

C. Sau đó dùng pipet gạn bỏ phõ̀n dung dịch , rƣ̉a 2 lõ̀n bằng nƣớc cṍt rụ̀i cho thờm 5 ml cụ̀n 90%, thuỷ phõn ở nhiệt độ 600C trong thời gian 2 giờ. Dung dịch thu đƣợc đem đo ở bƣớc sóng 485 nm. Đối ch ứng là mụ sẹo của cỏc giống khụng qua xƣ̉ lý thụ̉i khụ.