Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR) là sự kết hợp của hai phản ứng phiên mã ngƣợc (Reverse Transcriptase) và PCR để nhân lên đƣợc đoạn gen quan tâm từ RNA [3]. Kỹ thuật này gồm hai giai đoạn:
- Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất: Nguyên lý của phƣơng pháp này là sử dụng enzym phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase) để tổng hợp sợi cDNA thứ nhất từ RNA. Tùy theo mục đích của thí nghiệm mà các loại RNA đƣợc sử dụng là khác nhau. Nếu muốn nhân một đoạn gen của sinh vật nhân chuẩn mà không muốn có intron thì ngƣời ta thƣờng tổng hợp cDNA từ mRNA với mồi oligo(dT)s. Nếu là sinh vật nhân sơ hoặc virrut ngƣời ta có thể tổng hợp cDNA từ RNA tổng số với mồi ngẫu nhiên hoặc mồi đặc hiệu cho gen cần nhân. Khi mồi gắn bổ sung với sợi RNA khuôn, enzym phiên mã ngƣợc sẽ xúc tác cho quá trình tổng hợp cDNA từ các
nucleotit tự do có trong thành phần phản ứng ở một nhiệt độ thích hợp. Phản ứng tổng hợp cDNA chỉ xảy ra trong một chu kỳ, theo lý thuyết sau khi kết thúc phản ứng ta sẽ thu đƣợc lƣợng cDNA tƣơng ứng với lƣợng RNA khuôn ban đầu. Để tăng hiệu quả của qua trình tổng hợp, lƣợng mồi đƣợc cho vào lớn hơn rất nhiều lƣợng RNA khuôn và chất kìm hãm RNase cũng đƣợc đƣa vào để bảo vệ cho RNA khỏi bị cắt bởi RNase.
Khuếch đại gen bằng PCR: Sử dụng cDNA làm khuôn để khuếch đại gen quan tâm bằng phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu (gồm mồi xuôi và mồi ngƣợc). Nguyên tắc của kỹ thuật PCR đƣợc trình bày ở mục 1.6.3.