Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.Nhân đoạn 27aa và LTB bằng PCR
Hình 2.1. Sơ đồ quá trình gắn nối đoạn gen 27 aa với gen LTB
Phương pháp PCR được sử dụng để nhân những đoạn gen mong muốn với cặp mồi đặc hiệu. Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự protein vỏ của JEV đã công bố trên ngân hàng gen và trình tự đoạn LTB do TS. Lê Văn Sơn (Viện Công nghệ Sinh học, Việt Nam) cung cấp. Mồi 3’_27aa được gắn thêm 10 nucleotide đầu 5’ thuộc trình tự đoạn LTB và mồi 5’_LTB gắn thêm 10 nucleotide đầu 3’ thuộc trình tự đoạn 27aa. Việc bổ sung thêm này tạo vị trí kéo dài cho phản ứng PCR ghép nối hai đoạn 27aa và LTB. Các sản phẩm
Mồi 5’_27aa và 3’_27aa PCR 27aa PCR LTB Plasmid chứa LTB PCR nối 27aa và LTB pBT Lai Cắt bằng enzyme BamHI và NotI 27aa_LTB
27aa_LTB/BamHI/NotI pBT_27aa_LTB
PCR tạo thành được điện di trên gel agarose 1% trong đệm 1X TAE, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium bromide và thôi gel bằng bộ Kit của Qiagen. Thành phần PCR (thể tích 50µl) và chu trình nhiệt nhân đoạn 27aa với 35 chu kỳ như sau: 10X buffer: 5µl dNTP (10mM): 4µl MgCl2 (15mM): 3µl 5’_27aa(10pM): 2µl 3’_27aa(10pM): 2µl
Taq polymerase (5unit/µl): 0,5µl H2O: 33,5 µl
Thành phần PCR (thể tích 50µl) và chu trình nhiệt nhân đoạn LTB với 35 chu kỳ như sau: pBT_LTB (1:10): 1 µl 10X buffer: 5µl dNTP (10mM): 4µl MgCl2 (15mM): 3µl 5’_LTB(10pM): 2µl 3’_LTB(10pM): 2µl
Taq polymerase (5unit/µl): 0,5µl H2O: 33,5 µl
Thành phần PCR (thể tích 50µl) ghép nối đoạn 27aa và LTB gồm: Sản phẩm PCR 27aa: 1 µl
Sản phẩm PCR LTB: 1 µl 10X buffer: 5µl
dNTP (10mM): 4µl MgCl2 (15mM): 3µl
5’_27aa(10pM): 2µl 3’_LTB(10pM): 2µl
Taq polymerase (5unit/µl): 0,5µl H2O: 33,5 µl
Phản ứng ghép nối được tiến hành với chu trình nhiệt tương tự như phản ứng nhân đoạn gen LTB.