Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.7.Kiểm tra biểu hiện của protein tái tổ hợp
Biểu hiện của đoạn peptit kháng nguyên trong E.coli được kiểm tra bằng điện di trên gel SDS-polyacrylamide 12,5%. 1ml của dịch tế bào cảm ứng thu được được ly tâm thu cặn rồi hoà tan trong 50µl 2X Lamli buffer và biến tính
ở nhiệt độ khoảng 95o
C trong 10 phút. Sản phẩm điện di trên gel SDS-PAGE 12,5% (Sambrock,1989) trong vòng 2h ở hiệu điện thế 120V, nhuộm bản gel bằng cách lắc nhẹ 40 vòng trong dung dịch Coomassie Blue (Fermentas) trong 30 phút. Rửa bản gel trong dung dịch rửa khoảng 1 giờ và quan sát biểu hiện các băng protein.
Biểu hiện của gen Gus được kiểm tra bằng nhuộm trong dung dịch X- gluc. Hai ngày sau khi tiêm cấu trúc pPTN289_Gus, lá thuốc lá (đường kính 2cm) được ngâm qua đêm trong 500 µl dịch X-Gluc (1mM) ở 37oC. Rửa cồn 70% nhằm loại diệp lục và quan sát màu sắc của các mẫu lá.
Biểu hiện của đoạn peptit kháng nguyên trong tế bào thực vật được kiểm tra bằng phương pháp lai miễn dịch Western blot (Sambrock,1989). Mẫu lá được nghiền trong 100 µl dung dịch 2X Lameli buffer, ly tâm 13000rpm/5phút thu dịch protein và biến tính ở nhiệt độ khoảng 95o
C trong 10 phút. Sản phẩm điện di trên gel SDS-PAGE 12,5% (Sambrock,1989) trong vòng 2h ở hiệu điện thế 120V. Protein được chuyển sang màng Nitrocellulose nhờ hệ thống chuyển màng của Bio-Rad. Màng được ủ trong dung dịch blocking buffer là 5% sữa tách bơ trong dung dịch đệm PBST (0.1% Tween) trong 2h ở nhiệt độ phòng. Sau khi rửa màng 3 lần bằng PBST, màng được ủ với kháng thể đặc hiệu kháng cmyc (1:50, trong blocking buffer) trong 3h ở nhiệt độ phòng. Kháng thể này được cung cấp bởi Viện Di truyền Thực vật, IPK Gatersleben (Đức). Sau khi rửa, màng được ủ tiếp với kháng thể cộng hợp enzyme peroxidase kháng IgG chuột (1:2000, GE Healtheare) trong 1h. Màng được bổ sung dung dịch chứa cơ chất cho peroxidase ECL (GE Healtheare) sau khi đã được rửa lại ba lần bằng PBST trong 3 phút. Kết quả được hiện trên phim X-ray.
Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nhân đoạn gen 27 aa
Để nghiên cứu khả năng biểu hiện của đoạn gen 27 aa trước hết chúng tôi tiến hành phản ứng nhân đoạn gen này. Đoạn gen 27 aa được nhân lên trong phản ứng PCR với thành phần và chu trình nhiệt được mô tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Một điều đặc biệt là để tăng cường biểu hiện của đoạn peptide kháng nguyên nằm trên protein vỏ của virus viêm não Nhật Bản, chúng tôi đã tiến hành thay đổi thành phần một vài bộ ba mã hóa cho đoạn peptide 27 aa này nhằm mục đích biểu hiện tốt hơn ở trên thực vật. Cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen 27aa bao gồm toàn bộ 81 nucleotide của đoạn peptide kháng nguyên. Kết quả PCR đoạn gen 27 aa được thể hiện trên hình 3.1.
Hình 3.1: Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen 27aa
27aa: đoạn gen 27aa M: Marker 100bp
Trên hình 3.1 cho thấy sản phẩm PCR gen 27 aa xuất hiện duy nhất một băng với kích thước ~ 90bp, đây cũng chính là kích thước của đoạn gen 27 aa trên lý thuyết. Điều này chứng tỏ chúng tôi đã tiến hành phản ứng nhân đoạn gen 27 aa thành công. 200 100 bp 27aa M ~ 90bp