lập được
2.4.9.1. Xác định khả năng dung huyết
Cách tiến hành: Cấy vi khuẩn trên môi trƣờng thạch máu, đốt que cấy sau mỗi lần đổi góc cấy để mật độ vi khuẩn giảm dần. Để tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ, sau đó đọc kết quả:
Mẫu dƣơng tính :Xung quanh khuẩn lạc có vòng dung huyết sáng. Mẫu âm tính: Xung quanh khuẩn lạc không có vòng dung huyết
2.4.9.2. Xác định khả năng sản sinh độc tố ruột của vi khuẩn E.coli
Xác định khả năng sản sinh độc tố ruột của vi khuẩn E.coli bằng phƣơng pháp “Phản ứng khuyếch tán trong da thỏ” (Peterson, 1976, trích theo Nguyễn Khả Ngự, 2000 [36]). Cách tiến hành:
Chuẩn bị độc tố:
Chủng vi khuẩn E.coli thuần khiết trên môi trƣờng giữ giống đƣợc cấy chuyển sang 30ml môi trƣờng BHI lỏng đựng trong bình tam giác loại 100ml, bồi dƣỡng có lắc ở điều kiện 37oC/24h. Huyễn dịch độc tố thu đƣợc bằng cách li tâm canh trùng 10.000 - 12.000v/p ở điều kiện lạnh, trong 10 phút. Bỏ cặn bã lấy nƣớc trong và chia làm 2 phần:
+ Một phần bảo quản ở 4oC để thử độc tố không chịu nhiệt.
+ Phần còn lại đun cách thuỷ ở 80oC trong 10 phút sau đó bảo quản ở điều kiện 4o
C, để thử độc tố chịu nhiệt.
Chuẩn bị động vật thí nghiệm:
Chọn thỏ khoẻ có khối lƣợng 2,5 - 3 kg, cắt trụi lông ở phần lƣng, xoa thêm kem rụng lông để làm sạch hết phần chân lông còn lại, dùng bút dạ chia mảng da này thành những ô vuông nhỏ cạnh 2 x 2cm.
Chính giữa mỗi ô vuông, tiêm nội bì 0,1ml dịch độc tố đã đƣợc chuẩn bị ở trên, mỗi mẫu tiêm 2 ô ở 2 vị trí xa nhau, đối chứng âm là môi trƣờng BHI lỏng vô trùng. Sau khi tiêm 18h với độc tố không chịu nhiệt và sau 2h với độc tố chịu nhiệt, thỏ thí nghiệm đƣợc tiêm tĩnh mạch tai dung dịch Evan Blue, liều 40mg/kg thể trọng. Nuôi tiếp 2h, giết thỏ, lột da đọc kết quả phản ứng.
Đọc kết quả phản ứng:
+ Phản ứng đƣợc đánh giá là dƣơng tính khi ở trên ô thi nghiệm vùng thẩm xuất Evan Blue có diện tích ≥ 16mm2 (4x4mm).
+ Phản ứng cho kết quả âm tính khi ô da lƣng thỏ không có vùng thẩm xuất Evan Blue.
+ Phản ứng đƣợc coi là nghi ngờ khi trên ô da thỏ có vùng thẩm xuất Evan Blue nhƣng diện tích < 16mm2.