E. coli trực khuẩn hiếu khí tuỳ tiện, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 5- 400C, nhiệt độ thích hợp là 370C trong 24 giờ, pH thích hợp là 7,2-7,4 nhưng có thể phát triển ở pH từ 5,5-8. Vi khuẩn E. coli phát triển dễ dàng trên các
môi trường nuôi cấy thông thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản:
- Trên môi trường nước thịt: sau thời gian nuôi cấy ở 370C trong 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn E. coli phát triển rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống đáy, đôi khi hình thành màng mỏng xám nhạt trên bề mặt môi trường, môi trường có mùi phân thối.
- Trên môi trường thạch thường: bồi dưỡng ở 37oC trong 24 giờ vi khuẩn phát triển hình thành những khuẩn lạc tròn ướt, bóng láng, không trong suốt, màu tro nhạt, hơi lồi đường kính 2-3 mm. Nếu nuôi lâu hơn, khuẩn lạc chuyển màu gần như màu nâu nhạt và mọc rộng ra. Có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng M (Mucoid) và dạng R (Rough).
- Trên môi trường thạch máu: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn E. coli
hình thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu sáng, kích thước từ 1-2 mm, có thể có hoặc không có dung huyết tuỳ thuộc vào chủng.
- Trên môi trường thạch peptone: sau 18-24 giờ bồi dưỡng trong tủ ấm 37oC, vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc tròn ướt, màu xám, kích thước trung bình, mặt khuẩn lạc hơi lồi lên, có nếp nhăn và bề mặt láng bóng.
- Trên môi trường thạch MacConkey: sau khi nuôi cấy 24 giờ ở tủ ấm 37oC, hình thành khuẩn lạc màu hồng, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường.
- Trên môi trường Endo: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ mận chín, có hoặc không có màu ánh kim.
- Trên môi trường EMB (Eosin Methyl Blue): sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu tím đen có ánh kim.
- Trên môi trường thạch SS (Salmonella Shigella): sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn E. coli hình thành khuẩn lạc màu đỏ.
- Trên môi trường thạch Brilliant Green Agar: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC hình thành khuẩn lạc dạng S (Smooth), màu vàng chanh.
Vi khuẩn không mọc lên ở các môi trường Malasit và Mulerkauffmann, bị kiềm chế khi nuôi trong môi trường Wilson Blair.