Công nghệ sinh học đang có nhiều đóng góp có giá trị sản xuất nông nghiệp đặc biệt trong lĩnh vực chọn giống cây trồng với việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử với mục đích phân tích quan hệ di truyền và đánh giá hệ gen của thực vật thì RAPD là một kỹ thuật khá thuận lợi và có hiệu quả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả ứng dụng RAPD vào việc phân tích tính đa hình DNA của 14 giống ngô nếp địa phương.
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá ngô
Điều quan tâm hàng đầu của kỹ thuật tách chiết acid nucleic là thu nhận các phân tử ở trạng thái nguyên vẹn không bị phân huỷ bởi các tác nhân cơ học hoặc bị đứt gãy, đó là điều kiện đầu tiên quyết định cho sự thành công của quá trình nghiên cứu. Kết quả đo phổ hấp thụ DNA ở bước sóng 260nm và 280nm được thể hiện trong bảng 3.3.
Kết quả cho thấy, tỷ số A260/A280 dao động trong khoảng 1,8-2,0, chứng tỏ DNA tổng số thu được đảm bảo cho việc thực hiện kỹ thuật RAPD. Để kiểm tra chất lượng DNA tổng số, chúng tôi tiến hành điện di trên gel agarose, kết quả được thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.2. Hình ảnh điện di DNA tổng số của 14 giống ngô
Ký hiệu: 1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6.SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
36
Kết quả kiểm tra cho thấy DNA của các mẫu thu được không bị đứt gãy và sạch (hình 3.2). Khi đo OD ở bước sóng 260 nm thì chỉ có một đỉnh hấp thụ duy nhất là 260 nm (hình 3.3)
Bảng 3.3. Phổ hấp thụ DNA ở bước sóng 260nm và 280nm
Tên mẫu A260 A280 A260/A280
TL 0,018 0,0100 1,80 VN 0,015 0,0080 1,88 CB 0,016 0,0084 1,90 SLO 0,015 0,0079 1,89 T26 0,018 0,0090 2,00 SL 0,017 0,0090 1,88 SLV 0,013 0,0070 1,86 TQ 0,014 0,0070 2,00 ÔL 0,018 0,0090 2,00 ĐP 0,016 0,0085 1,88 LC 0,015 0,0078 1,92 SLT 0,016 0,0081 1,98 YB 0,015 0,0079 1,99 T4 0,017 0,0088 1,93
Như vậy, các mẫu DNA thu được đều có độ tinh sạch cao, có thể sử dụng cho các thí nghiệm phân tích DNA tiếp theo.
Sau khi tách chiết và tinh sạch DNA tổng số chúng tôi đã tiến hành pha loãng hàm lượng DNA về hàm lượng 10 ng/l để phục vụ cho nghiên cứu đa hình DNA.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
37
Hình 3.3. Phổ hấp thụ DNA của giống SLV đo ở bước sóng 260 nm
3.2.2. Kết quả nghiên cứu đa hình DNA bằng kỹ thuật RAPD
Để phân tích mối quan hệ di truyền của 14 giống ngô địa phương chúng tôi sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên có độ dài 10 nucleotide với kí hiệu M1, M2, M3, M4, M5, M6, M8, M9, RA159, UBC23. Tổng số băng xuất hiện đối với mỗi mồi ở từng giống ngô được thống kê và sử lý kết quả.
Kết quả cho thấy, trong 10 mồi nghiên cứu thì mồi M4 xuất hiện nhiều phân đoạn DNA được nhân bản (13 phân đoạn) với kích thước quan sát từ 0,22-1,70kb, nhiều nhất là ở giống LC xuất hiện 12 băng DNA được nhân bản. Tuy nhiên, cũng có một số mồi khuếch đại được rất ít băng, đó là mồi M1, M2, M5: Mồi M1 nhân bản được một băng DNA rõ nét ở hai giống YB và T4, mồi M2 nhân bản được một băng DNA rõ nét ở giống SLV, mồi M5 nhân bản được một băng DNA ở giống TQ và ÔL (Bảng 3.4)
Bảng 3.4 cho thấy, tổng số phân đoạn DNA được nhân bản ở từng giống với 10 mồi ngẫu nhiên dao động từ 41 đến 55 phân đoạn, trong đó giống LC có tổng số băng được nhân bản với 10 mồi nhiều nhất (55 băng), giống TL có số băng DNA được nhân bản với 10 mồi ít nhất (41 băng). Tổng số phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên thu được từ 14 giống ngô với 10 mồi là 674.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
38
Bảng 3.4. Số phân đoạn DNA xuất hiện ở từng giống ngô nghiên cứu
Mồi Giống M1 M2 M3 M4 M5 M6 M8 M9 RA159 UBC23 Tổng TL 3 2 4 7 4 8 4 2 5 2 41 VN 2 2 5 8 6 9 4 2 7 3 48 CB 3 2 4 9 4 9 4 3 9 4 51 SLO 2 2 4 11 6 9 4 2 7 3 50 T26 3 2 3 8 3 9 4 2 9 7 50 SL 3 2 3 9 6 9 4 2 8 7 53 SLV 2 1 3 8 5 9 4 3 7 7 49 TQ 3 3 4 10 1 10 4 2 5 5 47 ÔL 3 2 4 8 1 9 4 2 4 6 43 ĐP 3 2 4 8 2 10 4 3 2 7 45 LC 3 3 4 12 5 9 4 3 7 5 55 SLT 3 2 4 7 5 9 4 2 7 5 48 YB 1 2 4 7 4 10 4 2 8 3 45 T4 1 2 5 11 5 9 4 2 5 5 49 Tổng 35 29 55 123 114 256 112 64 90 69 674
Dưới đây là kết quả phân tích RAPD của từng mồi khi điện di sản phẩm RAPD trên gen agarose 2%.
Mồi M1
Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 14 giống ngô nếp với mồi M1 được thể hiện ở hình 3.4. Kết quả cho thấy, đây là mồi có số phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên ít nhất dao động từ 1 đến 3 phân đoạn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
39
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M1 của 14 giống ngô
Ký hiệu: M: Marker Smart
1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6.SL; 7.SLV;
8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4.
Kích thước các phân đoạn có chiều dài ước tính khoảng 0,7 kb đến 1,4 kb. Trong đó giống TL, CB, T26, SL, TQ, ÔL, ĐP, LC, SLT có số phân đoạn là 3, giống VN, SLO, SLV có 2 phân đoạn, còn giống YB, T4 chỉ có 1 phân đoạn được nhân bản.
Tính đa hình được thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện các phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên khi so sánh giữa các giống với nhau. Tại vị trí 1,40 kb chỉ có ba giống SLT, YB, T4 không có đoạn DNA được nhân bản, các giống còn lại đều xuất hiện phân đoạn DNA. Tại kích thước 1,20 kb có năm giống VN, SLO, SLV, YB, T4 không xuất hiện phân đoạn DNA, các giống còn lại đều xuất hiện phân đoạn. Ở vị trí 0,8kb chỉ có hai giống YB, T4 không phân đoạn còn lại đều phân đoạn. Ở kích thước 0,7 kb ba giống SLT, YB, T4 được phân đoạn, các giống còn lại đều mất phân đoạn này.
Như vậy, với mồi M1 số phân đoạn DNA được nhân bản ở 14 giống ngô nếp địa phương thể hiện sự sai khác trong cấu trúc DNA giữa các giống ngô nếp tại bốn vị trí 1,40 kb, 1,20 kb, 0,8 kb, 0,7 kb.
1,4 kb 1,2 kb 0,8 kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
40
Mồi M2
Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 14 giống ngô nếp với mồi M2 được thể hiện ở hình 3.5. Kết quả cho thấy, số phân đoạn DNA xuất hiện khi được nhân bản ngẫu nhiên là 3 phân đoạn. Ở kích thước khoảng 0,75kb, tất cả các giống đều xuất hiện băng này. Chỉ có hai giống TQ và LC xuất hiện băng DNA ở kích thước khoảng 1,2kb. Ở kích thước 1,5kb, giống SLV không xuất hiện băng DNA được khuếch đại, các giống còn lại đều xuất hiện băng này.
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M2 của 14 giống ngô Ký hiệu: M: Marker 1kb
1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6.SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4.
Mồi M3
Mồi M3 khuếch đại được 5 phân đoạn với kích thước từ 0,5-2,0kb. Ở kích thước 0,7kb, 1,0kb và 1,2kb, tất cả các giống ngô nghiên cứu đều xuất hiện.
Mồi M4
Kết quả điện di sản phẩm RAPD với mồi RA40 của 14 giống ngô ở hình 3.6 cho thấy, có từ 7 đến 12 phân đoạn có kích thước tương ứng khoảng 0,22 kb đến 1,7 kb. Giống LC có số phân đoạn DNA được nhân bản nhiều nhất 12
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 2.0 kb 1.5 kb 1.0 kb 0.75 kb 0.5 kb 0.25 kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
41
phân đoạn. Giống SLO, T4 có số phân đoạn DNA được nhân bản 11 phân đoạn. Ba giống TL, SLT, YB có số phân đoạn DNA ít nhất là 7 phân đoạn.
Đặc biệt, ở vị trí 0,32kb và 0,80kb chỉ có giống T4 xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản, các giống còn lại đều không thấy xuất hiện.
Ở kích thước 1,49 kb đến 1,70 kb hai giống SLT, YB không xuất hiện phân đoạn DNA, các giống còn lại đều xuất hiện. Tại kích thước 0,63 kb giống TL không xuất hiện phân đoạn DNA, các giống còn lại đều xuất hiện phân đoạn. DNA được nhân bản kích thước 0,60 kb thì các giống CB, SLO, SL, LC, SLT, YB đều xuất hiện phân đoạn DNA, các giống còn lại mất phân đoạn này. Ở vị trí 0,32 kb chỉ có giống LC xuất hiện phân đoạn DNA, các giống còn lại đều không xuất hiện phân đoạn DNA. Kích thước khoảng từ 0,22 kb đến 0,24 kb có các giống SLO, TQ, LC, T4 đều có phân đoạn DNA, 12 giống ngô còn lại đều không có phân đoạn này. Tại vị trí 1,25 kb, 1,10 kb, 1,0 kb, 0,72 kb, 0,46 kb tất cả các giống đều có phân đoạn DNA.
Như vậy, với mồi M4 có 13 kích thước (0,22 kb, 0,24 kb, 0,32 kb, 0,60 kb, 0,63kb, 0,80 kb, 1,49 kb, 1,70 kb) thể hiện tính đa hình và có 5 kích thước (1,25 kb, 1,10 kb, 1,0 kb, 0,72 kb, 0,46 kb) không biểu hiện tính đa hình.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M4 của 14 giống ngô
Ký hiệu: M: Marker Smart; 1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6.SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4. 1.5 kb 1.0 kb 0.2 kb 0.6 kb 0.8 kb 0.4 kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
42
Mồi M5
Mồi M5 khuếch đại được 6 phân đoạn với kích thước từ 0,27-1,2kb. Ở tất cả các kích thước xuất hiện đều biểu hiện tính đa hình.
Mồi M6
Mồi M6 khuếch đại được 10 phân đoạn với kích thước từ 0,2-2,0kb. Biểu hiện đa hình của các giống ngô nghiên cứu thể hiện ở hai băng kích thước 0,2kb và 0,25kb. Ở 8 kích thước còn lại (0,5kb; 0,7kb; 0,9kb; 1,0kb; 1,2kb; 1,4kb; 1,5kb; 2,0kb) không biểu hiện đa hình.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Hình 3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M6 của 14 giống ngô
Ký hiệu: M: Marker 1kb
1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6.SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4.
Mồi 8
Mồi M8 khuếch đại được 4 phân đoạn với kích thước từ 0,6-1,5kb. Các giống ngô nghiên cứu đều xuất hiện các băng DNA được nhân bản. Như vậy, mồi M8 không biểu hiện đa hình.
1.0 kb 2.0 kb 1.5 kb 0.75 kb 0.5 kb 0.25 kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
43
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M8 của 14 giống ngô
Ký hiệu: M: Marker 100bp; 1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6.SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4.
Mồi 9
Hình 3.9 cho thấy, mồi M9 khuếch đại được 3 phân đoạn với kích thước từ 0,4-0,6kb. Chỉ có kích thước 0,6kb biểu hiện đa hình, còn ở kích thước 0,4kb và 0,5kb không biểu hiện đa hình (tất cả các giống ngô đều xuất hiện 2 băng này).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M9 của 14 giống ngô
Ký hiệu: M: Marker 100bp 1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6.SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4. 1.2 kb 0.9 kb 0.6 kb 0.5 bk 0.4 kb 0.6 kp 0.5 kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
44
Mồi RA159
Kết quả phân tích điện di sản phẩm RAPD của 14 giống ngô nếp với mồi RA159 được thể hiện qua bảng 3.4 và hình 3.10. Kết quả cho thấy, xuất hiện từ 2 đến 9 phân đoạn DNA có kích thước tương ứng khoảng 0,21 kb đến 1,50 kb. Bốn giống VN, CB, T26, SL xuất hiện phân đoạn DNA ở vị trí 1,50 kb. Ở ba kích thước 0,7 kb, 1,0 kb và 1,20 kb giống ĐP không xuất hiện phân đoạn DNA, các giống còn lại đều xuất hiện phân đoạn. Giống VN, CB, T26, LC, SLT, YB xuất hiện phân đoạn được nhân bản ngẫu nhiên ở kích thước 0,8 kb. Còn ở kích thước 0,56 kb chỉ có giống ÔL không phân đoạn, các giống còn lại đều xuất hiện phân đoạn. Ở vị trí 0,54 kb 6 giống CB, SLO, T26, SL, SLV,YB đều phân đoạn DNA, các giống còn lại không phân đoạn. Tại kích thước 0,36 kb các giống TL, VN, TQ, ÔL, ĐP, T4 mất phân đoạn. Kích thước 0,21 kb tất cả các giống đều phân đoạn DNA.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi RA159 của 14 giống ngô
Ký hiệu: M: Maker Smart
1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6.SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4.
Như vậy với mồi RA159 có 9 kích thước trong đó có 8 kích thước (1,5 kb, 1,2 kb, 1,0 kb, 0,8 kb, 0,7 kb, 0,56 b, 0,54 kb, 0,36 kb) thể hiện tính đa hình và chỉ có kích thước 0,21 kb không biểu hiện tính đa hình.
1.5 kb 0.6 kb 2.0 kb 0.2 kb 0.4 kb 0.8 kb 1.0 kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
45
Mồi UBC23
Phân tích điện di sản phẩm RAPD của 14 giống ngô nghiên cứu với mồi UBC23 (hình 3.11) cho thấy, xuất hiện từ 2 đến 7 phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên.
Các phân đoạn DNA có kích thước ước tính khoảng từ 0,19 kb đến 0,64 kb. Trong đó bốn giống T26, SL, SLV, ĐP xuất hiện 7 phân đoạn DNA và giống TL xuất hiện phân đoạn DNA thấp nhất (chỉ có 2 phân đoạn). Các giống T26, SLV, ÔL, ĐP xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên tại kích thước 0,64 kb. Từ kích thước 0,48 kb đến 0,60 kb tất cả các giống đều xuất hiện phân đoạn DNA. Ở kích thước 0,4 các giống ngô nghiên cứu đều xuất hiện phân đoạn DNA (trừ giống TL). Tại vị trí 0,38 kb 9 giống ngô (TL, VN, CB, SLO,TQ, LC, SLT, YB, T4) mất phân đoạn DNA. Còn ở vị trí 0,36 kb 7 giống ngô (T26, SL, SLV, TQ, LC, SLT, T4) đều xuất hiện phân đoạn DNA, các giống ngô còn lại mất phân đoạn này. Ở vị trí 0,30 kb các giống đều mất phân đoạn DNA trừ giống LC, SLT, T4. Kích thước 0,24 kb chỉ có hai giống SL, ĐP xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản, các giống còn lại đều không xuất hiện phân đoạn. Các giống đều mất phân đoạn DNA tại vị trí 0,21 kb trừ giống ÔL. Hai giống CB, SL có phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên, các giống ngô còn lại đều không phân đoạn DNA ở vị trí 0,20 kb. Tại vị trí 0,19 kb các giống đều không xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên trừ bốn giống T26, SLV,TQ, ĐP đều xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
46
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi UBC23 của 14 giống ngô
Ký hiệu: M: Marker Smart; 1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6.SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4.
Như vậy, khi sử dụng mồi UBC23 tính đa hình biểu hiện ở các kích thước (0,64 kb, 0,4 kb, 0,38 kb, 0,36, 0,3 kb, 0,24 kb, 0,21 kb, 0,2 kb, 0,19 kb), còn 2 kích thước 0,60 kb và 0,48 kb không biểu hiện tính đa hình.
Tỷ lệ đa hình của các phân đoạn DNA xuất hiện
Với 140 phản ứng PCR được thực hiện chúng tôi đã điện di sản phẩm và thu được 674 phân đoạn DNA trong 68 loại phân đoạn DNA từ 14 giống ngô địa phương. Kích thước các phân đoạn DNA được nhân bản trong khoảng từ 0,2kb-2,0kb. Số lượng các phân đoạn tương ứng với mỗi mồi nằm trong khoảng 3-13 băng, trong đó mồi M2 và M9 nhân bản được