4. Phương pháp nghiên cứ u
3.2.1Phương pháp ELISA
Dựa trên kết hợp đặc hiệu của kháng nguyên (KN) và kháng thể (KT), người ta sử
dụng kháng nguyên của vi khuẩn lao nhằm phát hiện kháng thể lao cĩ trong huyết thanh hoặc dịch não tủy của bệnh nhân.
Phương này cĩ độ nhạy và độ đặc hiệu tương đối cao nhưng cĩ khả năng xảy ra phản ứng chéo với Mycobacteria khơng điển hình.
Gồm 3 phương pháp chính: ELISA gián tiếp, Sandwich ELISA, ELISA cạnh tranh
3.2.1.1. ELISA gián tiếp
Gồm các bước chính:
Hình 3.2 : Phương pháp ELISA gián tiếp “Nguồn: http://tusach.thuvienkhoahoc.com”
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 28
- Cố định kháng nguyên đã biết lên các đĩa. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết.
- Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác. Kháng nguyên chưa biết được hịa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu kháng nguyên chuẩn.
- Thêm dung dịch protein khơng tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bị (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh cĩ tác dụng ngăn cản sự hấp phụ
của các protein khác lên bề mặt của đĩa.
- Rửa bề mặt đĩa sau đĩ chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. Kháng thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố định mà khơng kết hợp với protein của huyết thanh.
- Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một kháng thể cịn dư (bước này cĩ thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện kháng nguyên đã gắn với enzyme).
- Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme cịn dư sẽđược loại bỏ.
- Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hĩa học (enzyme cĩ tác dụng như yếu tố khuyếch đại).
● Nhược điểm cơ bản: Bước cố định kháng nguyên khơng cĩ tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy kháng thể (cĩ nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của đĩa. Sandwich ELISA hạn chếđược nhược điểm này.
3.2.1.2. Sandwich ELISA:
Phương pháp được sử dụng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau:
(1) Chuẩn bị bề mặt cĩ gắn kháng thể.
(2) Khĩa tất cả những vị trí gắn kết khơng đặc hiệu trên bề mặt. (3) Phủ mẫu chứa kháng kháng nguyên cần xác định.
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 29
(5) Thêm các kháng thểđặc hiệu cho kháng nguyên cần chẩn đốn. (6) Thêm kháng thể thứ cấp đã được gắn với enzyme.
(7) Rửa đĩa, phần khơng gắn kết sẽ bị rửa trơi.
(8) Thêm cơ chất, enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu điện hĩa.
(9) ðo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hĩa... qua đĩ xác
định sự cĩ mặt và hàm lượng kháng thể.
♦ Các bước thường được thực hiện trong Sandwich ELISA: (1) Phủđĩa bằng kháng thể.
(2) Thêm mẫu cần xác định kháng nguyên, kháng nguyên (nếu cĩ) sẽ gắn với kháng thể.
(3) Kháng thể dùng để phát hiện được thêm vào và kết hợp với kháng nguyên. (4) Thêm kháng thể thứ cấp liên kết với enzyme. Kháng thể thứ cấp sẽ gắn với kháng thểđể phát hiện.
(5) Thêm cơ chất. Enzym sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu cĩ thể phát hiện và đo được.
Hình 3.3 : Các bước trong phương pháp Sandwich ELISA “Nguồn: http://tusach.thuvienkhoahoc.com”
SVTH: LƯ NHẬT HUY Trang 30
3.2.1.3. ELISA cạnh tranh:
(1) "Ủ" kháng thể khơng được đánh dấu với kháng nguyên.
(2) ðưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm cĩ chứa kháng nguyên.
(3) Rửa đĩa, kháng thể khơng được gắn kết sẽ bị rửa trơi. Lượng kháng nguyên càng lớn, lượng kháng thể gắn thành cơng với kháng nguyên trong đĩa càng thấp do "cạnh tranh".
(4) Thêm kháng thể thứ cấp (kháng thể của kháng thểở bước 1). Kháng thể thứ cấp gắn với enzym.
(5) Thêm cơ chất. Lượng enzym cịn dư sẽ giải phĩng tín hiệu hỳnh quang hay tín hiệu màu.
Trong phương pháp này, hàm lượng kháng nguyên gốc càng cao, tín hiệu sản sinh càng yếu.
Một số trường hợp, enzym được gắn với kháng nguyên chứ khơng phải kháng thể.