CI Chloroform-isoamyl alcohol
2.2.7. Phơng pháp FISH
FISH (Fluorescence in situ hybridization) là phơng pháp lai sử dụng các đầu dò thích hợp bắt cặp với rRNA nhằm xác định phả hệ của vi sinh vật trong quần xã một cách trực tiếp, không qua bớc phân lập và nuôi cấy (Amann và cs, 1992).
Chuẩn bị hóa chất:Formaldehyde 37% PBS 10ì
5 M NaCl 1 M Tris-HCl
0,5 M EDTA SDS 10%
Formamide DAPI (0,02 mg/ml) Đầu dò: là các đoạn oligonucleotide dài 18 - 20 nucleotide gắn chất huỳnh quang sulphoindocyonide (CY3, hấp phụ bớc sóng 552 nm). Các đầu dò đã sử dụng trong nghiên cứu này đợc liệt kê trong bảng 6 (nồng độ 2 ng/μl).
Bảng 6. Các đầu dò sử dụng trong nghiên cứu. Tên đầu dò Đối tợng bắt cặp Trình tự (5’→ 3’) Formamide (%) NaCl (mM)
ALF968 α-Proteobacteria GGTAAGGTTCTGCGCGTT 20 225
BET42a β-Proteobacteria GCCTTCCCACTTCGTTT 35 80
GAM42a γ-Proteobacteria AAACGATGTGGGAAGGC 35 80
Các bớc tiến hành:
Cố định mẫu:
- Hoà 0,5 g mẫu đất hoặc bùn trong 1,5 ml PBS 1ì.
- Bổ sung formaldehyde vào mẫu tới nồng độ 2 - 4% và cố định ở 4°C trong thời gian ít nhất là 30 phút nhng không quá 24 giờ.
- Ly tâm, loại PBS 1ì và bổ sung 1,5 ml hỗn hợp dung dịch etanol/PBS (1:1). - Bảo quản tế bào đã cố định tại −20°C.
Bảng 7. Chuẩn bị đệm lai và đệm rửa.
Dung dịch gốc Thể tích
2 ml đệm lai 50 ml đệm rửa
Nồng độ cuối
5 M NaCl 360 μl (900 mM) Phụ thuộc vào từng đầu dò
1 M Tris/HCl 40 μl 1 ml 20 mM
Formamide % phụ thuộc vào từng đầu dò (bảng 6)
0,5 M EDTA 0,5 ml 5 mM
Nớc cất vô trùng dẫn tới 2 ml dẫn tới 50 ml SDS 10% (bổ sung cuối
cùng để tránh kết tủa) 2 μl 50 àl 0,01% Lai với đầu dò:
- Lấy 15 - 20 àl mẫu hoà với 2 ml nớc cất vô trùng và đa tế bào trên màng polycarbonate (0,2 μm).
- Để khô mẫu trong không khí và bảo quản trong hộp kín tại −20°C cho đến khi sử dụng. - Chia màng thành các phần nhỏ để tiến hành lai (một màng có đờng kính 25 mm có thể chia làm 6 - 10 phần sử dụng cho các đầu dò khác nhau). Dùng bút chì đánh dấu mẫu (bằng số).
- Chuẩn bị 2 ml đệm lai trong ống eppendorf (bảng 7).
- Chuẩn bị dung dịch đầu dò: trộn 2 àl đầu dò với 18 àl đệm lai trong ống eppendorf 0,5 ml, giữ trong đá, tránh ánh sáng.
- Đặt một miếng giấy thấm vào ống falcone 50 ml, đổ phần đệm lai còn lại vào ống. - Đặt mảnh màng polycarbonate lên lam kính, mặt có mẫu lên trên. Các mẫu lai với cùng một đầu dò có thể đặt cùng trên một lam kính.
- Nhỏ hỗn hợp đầu dò lên các mẫu và đặt toàn bộ lam kính vào ống falcon có miếng giấy lọc thấm đệm lai đã chuẩn bị trớc (ở t thế nằm ngang) và lai ở 46°C trong thời gian ít nhất là 90 phút (nhng không quá 3 giờ).
- Chuyển nhanh mẫu sau khi lai vào đệm rửa đã đợc làm nóng trong bể ổn nhiệt tại 48°C trong 15 phút. Gạn bớt đệm và đổ mẫu ra đĩa petri. Dùng kẹp gắp mẫu, nhúng qua nớc cất vô trùng trong vài giây và đặt lên giấy thấm cho khô (mặt có mẫu ở trên). Nhuộm đối chứng và quan sát:
- Để nhuộm đối chứng, nhỏ 50 àl dung dịch DAPI lên mỗi mẫu, giữ 3 phút trong tối, sau đó rửa nhanh trong nớc cất và rửa trong cồn 80% trong vài giây rồi để khô trong không khí (đặt trong hộp tối). Mẫu có thể đợc bảo quản trong −20°C trong vài ngày mà tín hiệu huỳnh quang không bị thay đổi.
- Phủ một lớp Citifluor/Vecta shield (4:1 v/v) và quan sát dới kính hiển vi huỳnh quang.