CI Chloroform-isoamyl alcohol
3.7. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, phân loại và hoạt tính sinh học của các chủng
chủng vi khuẩn đại diện
Hai chủng vi khuẩn IN2 và IN12 đại diện cho hai nhóm vi khuẩn chiếm u thế trong các môi trờng nghiên cứu là Anaeromyxobacter và Paracoccus (phần 3.6). Hơn thế, trong quá trình thí nghiệm chúng tôi nhận thấy rằng đây là hai chủng thể hiện khả năng sinh trởng cao nhất trong số các chủng đã phân lập đợc. Để tìm hiểu khả năng ứng dụng của nhóm vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh lý của hai chủng này.
Kết quả nghiên cứu cho thấy hai chủng IN2, IN12 rất khác nhau về đặc điểm sinh lý (bảng 10). Trong khi chủng IN2 là vi khuẩn kỵ khí bắt buộc thì chủng IN12 là vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, có khả năng hô hấp bằng oxy (sinh trởng hiếu khí). Ngoài nitrate đợc sử dụng làm chất nhận điện tử cuối cùng, chủng IN2 còn có khả năng sử dụng Fe(III) làm chất nhận điện tử còn chủng IN12 không có khả năng này. Cả hai chủng đều không sinh trởng bằng khử sulfate (SO42−).
Bảng 10. Đặc điểm sinh lý của hai chủng vi khuẩn IN2 và IN12. Ký hiệu: (−): không sinh trởng; (+ đến +++): các mức độ sinh trởng tăng dần.
Đặc điểm sinh lý IN2 IN12
Hô hấp bằng oxy (sinh trởng hiếu khí) − + +
Sinh trởng phụ thuộc độ mặn của môi tr- ờng (% NaCl) 0% − + + + 1% + + + + + + 2% + + + + + + 3% + + + + + + 4% + + + + + 5% + + + +
Chất cho điện tử (để khử nitrate)
Lactate + + + + + + Acetate + + + + + + Ethanol + + + + + + Benzoate + + + + Chất nhận điện tử (oxy hoá lactate)
Nitrate + + + + + +
Fe(III) + + + −
Sulfate − −
Đối với các nguồn điện tử khác nhau phục vụ cho quá trình khử nitrate, ngoài Fe(II) đã đợc sử dụng để phân lập và nuôi cấy từ ban đầu, lactate, acetate, benzoate và ethanol đều đợc oxy hoá bởi hai chủng IN2 và IN12. Trong trờng hợp benzoate, một acid hữu cơ chứa vòng thơm và thờng khó bị oxy hoá hơn các hợp chất còn lại, chủng IN12 thể hiện khả năng oxy hoá kém hơn hẳn so với chủng IN2.
Độ mặn là một trong các yếu tố môi trờng quan trọng ảnh hởng đến sinh lý của vi khuẩn trong tự nhiên, do vậy ở đây chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hởng của nồng độ muối trong môi trờng đối với khả năng sinh trởng của hai chủng vi khuẩn quan tâm. Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng IN2 có nhu cầu về muối để sinh trởng còn chủng IN12 thì không. Trong khi chủng IN12 có thể sinh trởng trong môi trờng không cần bổ sung NaCl thì chủng IN2 chỉ phát triển khi NaCl có mặt ở nồng độ 1% trở lên. Tuy nhiên, chủng IN2 lại có khả năng chịu muối cao hơn IN12,
chủng này vẫn phát triển tốt ở nồng độ muối 5% trong khi đó tốc độ sinh trởng của IN12 bị ảnh hởng đáng kể ở các nồng độ muối cao hơn 3%. Điều này cũng phù hợp với đặc điểm phân bố của hai chủng vi khuẩn trong tự nhiên, cụ thể là chủng IN2 đại diện cho nhóm vi khuẩn đợc tìm thấy ở nhiều dạng môi trờng khác nhau, bao gồm cả nớc ngọt và nớc lợ, trong khi đó chủng IN12 đại diện cho nhóm chỉ tìm thấy ở bùn đáy thuỷ vực nớc ngọt.
Chủng IN2 gồm những tế bào dạng trực khuẩn, kích thớc 1 ì 4 - 5 μm, chuyển động tích cực (hình 16). So sánh trình tự gần đủ gen mã hóa cho gen 16S rDNA với ngân hàng dữ liệu GenBank cho phép xếp chủng IN2 vào chi
Anaeromyxobacter (loài gần gũi nhất là A. dehalogenans, 99% tơng đồng). Nh vậy chủng IN2 đợc bổ sung vào danh sách chi Anaeromyxobacter với tên khoa học là
Anaeromyxobacter sp. IN2 và mã trình tự gen 16S rDNA trong GenBank là FJ939131 (hình 16). Anaeromyxobacter là một chi đợc biết đến với các đại diện sinh trởng kỵ khí bắt buộc bằng oxy hoá các hợp chất hữu cơ để khử Fe(III) (Treude và cs, 2003). Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên vi khuẩn Anaeromyxobacter mà đại diện là chủng IN2 thể hiện khả năng sinh trởng bằng oxy hoá Fe(II), khử nitrate, tuy nhiên hình thức sinh trởng này không vợt trội so với sinh trởng kỵ khí khử Fe(III). Hình thức sinh trởng tơng tự cũng xảy ra với các chủng thuộc chi Geobacter (Weber và cs, 2006 c). Nghiên cứu này chỉ ra rằng trầm tích có chứa các chủng vi khuẩn
Geobacter sp. có khả năng oxy hóa Fe(II) và khử Fe(III) cùng với khử nitrate thành NH4+.
Anaeromyxobacter sp. IN2 0,5 μm
Hình 16. Hình thái tế bào và vị trí phân loại của hai chủng IN2 và IN12. Hình thái tế bào đợc quan sát trên kính hiển vi quang học, độ phóng đại 1000 lần (đơn vị = 5 àm). Cây phân loại đợc dựng theo phơng pháp neighbor-joining, đơn vị
= 0,02 Knuc trong trình tự nucleotide. Các số hiển thị ở các vị trí phân nhánh là kết quả phân tích bootstrap đối với 1000 phép so sánh (chỉ có các giá trị trên 500 đợc
trình bày trên hình). B. subtilis là loài vi khuẩn đợc chọn làm outgroup.
Chủng IN12 gồm những tế bào hình oval có kích thớc 1,5 ì 1.5 - 2 μm, chuyển động chậm. So sánh trình tự gần đủ của gen 16S rDNA với ngân hàng dữ liệu GenBank cho phép xếp chủng IN12 vào chi Paracoccus (loài gần gũi nhất là P. aminovorans, 98% tơng đồng). Paracoccus là chi vi khuẩn nằm trong phân lớp α-
Proteobacteria, gồm nhiều loài có khả năng hô hấp bằng oxy (sinh trởng hiếu khí), đồng thời hô hấp bằng khử nitrate (Shapleigh, 2000). Nhiều đại diện của chi
Paracccus đợc tìm thấy trong các điều kiện tối u cho khử nitrate, nh đáy các thuỷ vực (Shapleigh, 2000) hay trong các hệ thống xử lý nớc thải loại bỏ nitơ, ví dụ nh P. denitrificans, P. ferooxydans (Bitton, 1999). Chủng IN12 đợc định danh khoa học là
Paracoccus sp. IN12 và có mã trình tự gen 16S rDNA trong GenBank là GU084390 (hình 16).
Mặc dù cùng đợc phân lập thông qua bớc làm giàu bằng dãy MPN với chất cho và nhận điện tử tơng ứng là Fe(II) và nitrate, hai hủng IN2 và IN12 lại đại diện cho hai nhóm vi khuẩn khác nhau tham gia chu trình sắt ở môi trờng trung tính, cụ thể là oxy hoá Fe(II) thành Fe(III) bằng nitrate và khử Fe(III) thành Fe(II) bằng các hợp chất hữu cơ. Tuy cũng có khả năng sinh trởng cao trong môi trờng có Fe(II) và
nitrate nhng chủng IN2 sẽ khó có khả năng ứng dụng vào mục đích loại bỏ Fe(II) và nitrate trong các nguồn nớc ô nhiễm vì bị ảnh hởng bởi khả năng sử dụng Fe(III) làm chất nhận điện tử cuối cùng để tạo năng lợng. Khác với IN2, chủng IN12 là một vi khuẩn oxy hoá Fe(II) khử nitrate điển hình. Hơn thế nữa, chủng vi khuẩn này có khả năng sinh trởng trong nhiều đều kiện môi trờng khác nhau nh có mặt hay không có mặt oxy, thích nghi với nhiều loại nguồn điện tử khác nhau (nh Fe(II), các acid hữu cơ, rợu) và sinh trởng tốt trong môi trờng có độ mặn dao động trong dải 0 - 3% (đặc trng cho cả môi trờng nớc ngọt và nớc lợ). Với những u điểm kể trên, chủng IN12 hứa hẹn có tiềm năng ứng dụng vào việc loại bỏ nitơ và Fe(II) trong các nguồn nớc ô nhiễm.
Hoạt tính oxy hóa Fe(II) và khử nitrate của chủng IN12 đợc xác định ở điều kiện kỵ khí với Fe(II) là chất cho điện tử và nitrate làm chất nhận điện tử cuối cùng. Kết quả xác định nồng độ các chất cho và nhận điện tử trong môi trờng biến đổi theo thời gian cho thấy sự giảm nồng độ Fe(II) và nitrate diễn ra song song với tốc độ đáng kể (hình 17). Bên cạnh đó khả năng sử dụng Mn(II) làm chất cho điện tử để khử nitrate cũng đợc kiểm tra, tuy nhiên chủng IN12 không thể hiện sinh trởng rõ rệt trong điều kiện nuôi cấy này. Theo một số nghiên cứu đã công bố, hoạt tính oxy hoá Mn(II), khử nitrate bằng con đờng sinh học đợc xác định trong một số quần xã vi khuẩn ở đáy các thuỷ vực, nhng cho đến nay cha có chủng vi khuẩn nào đợc phân lập trong phòng thí nghiệm với hoạt tính kể trên (Vandenebeele và cs, 1995; Gounot, 1994).
1.5 2 2.5 3 3.5 0 1 2 3 4 5
Thời gian (ngày)
N itr at e (m M ) 1.5 2 2.5 3 3.5 Fe (I I) (m M )
Hình 17. Loại bỏ Fe(II) (•) và nitrate () trong môi trờng do tác động của chủng vi khuẩn IN12.
Kết luận
1. Số lợng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate trong các mẫu bùn thu thập ở thủy vực nớc ngọt, chân ruộng ngập nớc và vùng nớc lợ ven biển nằm trong khoảng 103 - 104 tế bào/g, trong đó mẫu bùn ở chân ruộng ngập nớc có số l- ợng tế bào vi khuẩn này cao hơn cả (9,3 ì 103 tế bào/g).
2. Kết quả phân tích DGGE cho thấy nhóm vi khuẩn thuộc chi Anaeromyxobacter
chiếm u thế ở cả ba dạng môi trờng sinh thái nghiên cứu và đóng vai trò khép kín chu trình chuyển hoá sắt trong các môi trờng nghiên cứu thông qua khả năng sinh trởng kỵ khí khử Fe(III). Paracoccus và Pseudomonas là hai nhóm vi khuẩn chính thực hiện quá trình oxy hoá Fe(II), khử nitrate tơng ứng ở mẫu bùn đáy ao và chân ruộng ngập nớc. Đại diện thuộc chi Pseudomonas
(chủng IN7) cũng đợc tìm thấy trong môi trờng nớc lợ ven biển, và có thể đóng vai trò quan trọng trong môi trờng này.
3. Vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate tại các môi trờng nghiên cứu có tính đa dạng khá cao. 12 chủng đơn phân lập từ các mẫu MPN đợc xếp vào 5 nhóm khác nhau trong phân tích ARDRA sử dụng hai enzyme giới hạn HaeIII và
MspI, trong đó mẫu trầm tích ven biển thể hiện tính đa dạng di truyền cao hơn cả với 4 chủng thuộc vào 4 nhóm ARDRA khác nhau.
4. IN2 và IN12 đại diện cho hai nhóm vi khuẩn tham gia chu trình chuyển hoá sắt tại các môi trờng nghiên cứu, trong đó chủng IN2 tham gia khử Fe(III) thành Fe(II) bằng các hợp chất hữu cơ và chủng IN12 tham gia oxy hoá Fe(II) thành Fe(III) bằng nitrate. Hai chủng này có khả năng sinh trởng với nhiều chất cho điện tử (lactate, acetate, ethanol, benzoate) và nhận điện tử (nitrate, Fe(III)) tại các nồng độ muối khác nhau trong môi trờng.
5. So sánh trình tự gần đủ của gen 16S rDNA với các loài đã công bố trên GenBank cho phép định danh hai chủng vi khuẩn IN2 và IN12 lần lợt là
Anaeromyxobacter sp. IN2 (mã trình tự đăng ký trên GenBank là FJ939131) và Paracoccus sp. IN12 (mã trình tự đăng ký trên GenBank là GU084390).
hớng nghiên cứu tiếp theo
1. Với hoạt tính cao trong việc oxy hoá Fe(II) và khử nitrate, chủng IN12 có tiềm năng ứng dụng thực tế trong việc xử lý các nguồn nớc nhiễm nitơ và ion kim loại Fe(II).
2. Nghiên cứu tìm giá thể phù hợp để tạo chế phẩm chứa vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate.
3. Nghiên cứu thử nghiệm áp dụng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate để xử lý nớc ngầm nhiễm sắt và nitơ.
Tài liệu tham khảo
Tài liệu Tiếng việt
1. Lê Đức (2004), Một số phơng pháp phân tích môi trờng, NXB ĐHQGHN.
2. Mai Thanh Truyết (1997), “Ô nhiễm nitrate trong nớc vùng châu thổ sông Cửu long”, http://www.mekongriver.org/trnitrate.html
3. TCVN 5944 (1995), “Chất lợng nớc - Tiêu chuẩn chất lợng nớc ngầm”,
http://www.epe.edu.vn/index.php?cPath=4&page=5&nID=111
4. Trần Thị Kiều My, Nguyễn Hà Thanh (2006), “Chuyển hóa sắt trong cơ thể và quá tải sắt ở một số bệnh máu” Hội nghị Khoa học ngành Huyết học – Truyền máu Quốc gia.
5. Viện Vệ sinh Dịch tễ Tây nguyên (2009) “Đánh giá ô nhiễm kim loại nặng tại nguồn nớc ở Tây nguyên” Thông Tấn Xã Việt Nam.
Tài liệu Tiếng Anh
6. Amann RI, Krumholz L, Stahl DA (1990), “Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic, and environmental studies in microbiology” J Bacteriol, 172 (2), pp. 762-770.
7. Amann RI, Stromley J, Devereux R. Key R, Stahl DA (1992), “Molecular and microscopic identification of sulfate-reducing bacteria in multispecies biofilms”, Appl Environ Microbiol, 58 (2), pp. 614-623.
8. Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH (1995), “Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation”, Microbiol Rev, 59 (1), pp. 143-169.
9. American public health association (1996), Standard methods for the examination of water and waste water including bottom sediments and sludge, 604-609. 10. Appia-Ayme C, Guiliani N, Ratouchniak J, Bonnefoy V (1999),
cytochrome oxidase, and rusticyanin in Thiobacillus ferrooxidans ATCC 33020”, Appl Environ Microbiol, 65 (11), pp. 4781-4787.
11. Avery AA (1999), “Infantile methemoglobinemia: Reexamining the role of drinking water nitrates”, Environ Health Perspect, 107 pp. 583-586.
12. Avrahami S (2002), Doctor thesis: Effects of temperature, soil ammonium concentration and fertilizer on activity and community structure of soil ammonia oxidizers, The faculty of Biology of the Philipps University of Marburg, Germany.
13. Bano N, Hollibaugh JT (2000), “Diversity and distribution of DNA sequences with affinity to ammonia-oxidizing bacteria of the β Subdivision of the class
Proteobacteria in the Arctic Ocean”, Appl Environ Microbiol, 66 (5), pp. 1960-1969.
14. Bano N, Hollibaugh JT (2002), “Phylogenetic composition of bacterioplankton assemblages from the Arctic Ocean”, Appl Environ Microbiol, 68 (2), pp. 505-518.
15. Benz M, Brune A, Schink B (1998), “Anaerobic and aerobic oxidation of ferrous iron at neutral pH by chemoheterotrophic nitrate-reducing bacteria”, Arch Microbiol, 169 pp. 159-165.
16. Bitton G (1999), Wastewater Microbiology, Wiley-Liss, Inc. Toronto, Canada. 17. Blake RC, Waskowsky J, Harrison AP (1992) “Respiratory components in
acidophilic bacteria that respire on iron”, Geomicrobiol J,10 pp. 173-192. 18. Brewer PG, Spencer DW (1971), “Colorimetric determination of manganese in
anoxic waters”, Limnol Oceanogr, 16 (1), pp. 107-110.
19. Bruce RA, Achenbach LA, Coates JD (1999), “Reduction of (per)chlorate by a novel organism isolated from paper mill waste”, Environ Microbiol, 1 (4), pp. 319-329.
20. Chaudhuri SK, Lack JG, Coastes JD (2001), “Biogenic magnetite formation through anaerobic biooxidation of Fe(II)”, Appl Environ Microbiol, 67 (6), pp. 2844-2848.
21. Croal LR, Jiao Y, Newman DK (2007), “The fox operon from Rhodobacter
strain SW2 promotes phototrophic Fe(II) oxidation in Rhodobacter capsulatus SB1003”, J Bacteriol, 189 (5), pp. 1774-1782.
22. Crump BC, Kling GW, Bahr M, Hobbie JE (2003), “Bacterioplankton community shifts in an Arctic lake correlate with seasonal changes in organic matter source”, Appl Environ Microbiol, 69 (4), pp. 2253-3368.
23. Davies CE, Hill KE, Wilson MJ, Stephens P, Hill CM, Harding KG, Thomas DW (2004), “Use of 16S ribosomal DNA PCR and denaturing gradient gel electrophoresis for analysis of the microfloras of healing and nonhealing chronic venous leg ulcers”, J Clin Microbiol, 42 (8), pp. 3549-3557.
24. Delong EF, Wickham GS, Pace NR (1989), “Phylogenetic stain: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells”, Science, 243 (4896), pp. 1360-1363.
25. Dhillon A, Edwards K, Webb E, Roger D, Sogin M (2005), “Marinobacter aquaeolei gene expression studies for clues to neutrophilic iron oxidation”, NAI 2005 Biennial Meeting of the NASA Astrobiololy Institute.
26. DIN 38406-E1-1 (1983), German standard methods for the examination of water, waste water and sludge, cation (group E), determination of iron (E1). 27. Downes FP, Ito K (2001), Compendium of methods for the microbiological
examination of foods, American Public Health Association, Washington, D.C. 28. Edwards KJ, Rogers DR, Wirsen CO, McCollom TM (2003), “Isolation and
characterization of novel psychrophilic, neutrophilic, Fe-oxidizing, chemolithoautotrophic α- and γ-Proteobacteria from the deep sea”, Appl Environ Microbiol, 69 (5), pp. 2906-2913.
29. Ehrenberg (1919), “Gallionella ferruginea”, In Ellis D, Iron bacteria, Methuen & Co. Ltd.
30. Ehrenreich A, Widdel F (1994), “Anaerobic oxidation of ferrous iron purple bacteria, a new type of phototrophic metabolism”, Appl Environ Microbiol, 60 (12), pp. 4517-4526.
31. Ehrlich HL, Newman DK (2008), Geomicrobiology, fifth edtion, CRC Press. 32. Emerson D, Moyer C (1997), “Isolation and characterization of novel iron-
oxidizing bacteria that grow at circumneutral pH”, Appl Environ Microbiol, 63 (12), pp. 4784-4792.
33. Emerson D (2000), “Microbial oxidation of Fe(II) and Mn(II) at circumneutral pH”, In Lovley DR, Environmental microbe-metal interaction, ASM Press. 34. Emerson D, Weiss JV (2004), “Bacterial iron oxidation in circumneutral
freshwater habitals: findings from the field and the laboratory”,
Geomicrobiol J, 21 pp. 405-414.
35. Felsenstein J (1985), “Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap”, Evolution, 39 pp. 783-791.
36. Fischer SG, Lerman LS (1979), “Length-independent separation of DNA restriction fragments in two-dimensional gel electrophoresis”, Cell, 16 (1), pp. 191-200.
37. Ghiorse WC (1984), “Biology of iron- and manganese- depositing bacteria”,
Annu Rev Microbiol, 38 pp. 515-550.
38. Giovannoni SJ, Delong EF, Olsen GJ, Pace NR (1988), “Phylogenetic group- specific oligodeoxynucleotide probes for identificatio of single microbial cells” J Bacteriol, 170 (2), pp. 720-726.
39. Giovannoni SJ, Britschgi TB, Moyer CL, Field KG (1990), “Genetic diversity in Sargasso Sea bacterioplankton”, Nature, 345 pp. 60-63.
40. Gounot AM (1994), “Microbial oxidation and reduction of manganese: Consequences in groundwater and applications”, FEMS Microbiol Rev, 14 (4), pp. 339-349.
41. Hafenbradl D, Keller M, Dirmeier R, Rachel R, Rossagel P, Burggraf S, Huber H, Stetter KO (1996), “Ferroglobus placidus gen. nov., sp. nov., A novel